基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的沉香2-(2-苯乙基)色酮聚合物成分分析

2023-11-11 15:55阳辛凤梅文莉李薇庞朝海董文化潘永波张群
热带作物学报 2023年9期
关键词:聚物同分异构乙基

阳辛凤 梅文莉 李薇 庞朝海 董文化 潘永波 张群

关键词:沉香;2-(2-苯乙基)色酮聚合物;超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱

中图分类号:Q949.761.1;R284.1 文献标识码:A

沉香( agarwood ) 是由瑞香科沉香属(Aquilaria spp.)植物木质部组织及其分泌物共同组成的木材[1-3],主要分布于印度尼西亚、马来西亚、越南、柬埔寨、中国等国家[3-5]。沉香是一种珍稀药材,具有安神镇静、消炎止痛、抗菌、抗氧化、抗心肌缺血、抗肿瘤等功效[3, 6-9]。2-(2-苯乙基)色酮聚合物(PPECs)是与沉香药理活性密切相关的一类重要生物活性物质[3]。根据结构特征,PPECs 分为3 类,由2 个或3 个2-(2-苯乙基)色酮单元结合形成的2-(2-苯乙基)色酮二聚物(DPECs)和2-(2-苯乙基)色酮三聚物(TPECs),以及由萜类与2-(2-苯乙基)色酮单元结合形成的萜类-2-(2-苯乙基)色酮二聚物(SPECs)[3-5]。在已有报道中,气质联用技术是对沉香中化学成分进行分析的主要方法,广泛用于萜类为主的众多挥发性成分和低分子量2-(2-苯乙基)色酮类成分的鉴定[10-16]。然而沉香中PPECs 分子量较大,沸点高, 不适于气质联用分析。目前对沉香PPECs 的分析多沿用传统的先分离纯化后结构鉴定方式[17-20]。据报道,从不同产地、不同品种沉香中分离鉴定的2-(2-苯乙基)色酮类成分约250个,其中PPECs 约100 个[3-5]。近年来,超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)开始应用于沉香中色酮类成分的鉴定,鉴定了AH12、AH13、AH15、AH21、methoxyAH21、dehydroxy AH21 等PPECs[5, 21-23]。PPECs不仅具有生物活性,而且多样性丰富,是沉香产地鉴定、结香方式鉴别的重要标志性成分[5, 21-23],因此有必要深入挖掘沉香PPECs 分子资源。

本研究采用超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS/MS)对沉香PPECs 成分进行鉴定,有助于深入了解沉香药材的药物组成,为沉香药材的现代化与标准化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 沉香对照药材购自中国食品药品检定研究院。

1.1.2 试剂 乙腈(色谱纯),购自德国默克公司;甲酸(色谱纯),购自美国Fisher 公司。超纯水为Milli-Q 系统纯化水,其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱仪:Triple TOF 5600+型,安装有Analyst®TF 1.6 工作站、PeakView® 2.0 软件,美国ABSCIEX 公司;电子天平:ME204 型,感量0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多公司;电子天平:JJ500 型,感量0.01 g,江苏常熟市双杰测试仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 提取 称取沉香对照药材粉末0.50 g,置于50 mL 具塞三角瓶中,加入甲醇10 mL,称重,浸泡0.5 h,超声处理(功率250 W,频率40 KHz)1 h,冷却,再次称重,滴加甲醇补足重量,摇匀,于10 000 r/min 离心5 min,取上清液过0.22 μm有机滤膜,待上机分析。

1.2.2 仪器参数 液相色谱仪器参数:WatersAtlantis T3 色谱柱(2.1 mm×50 mm, 3.0 μm);流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱:0~2 min,5% B;2~5 min,5%~15% B;5~10 min,15%~20% B;10~28 min,20%~25% B;28~50 min,25%~35% B;50~60 min,35%~40% B;60~80 min,40%~90% B;80~87 min,90% B;87~88 min , 90%~5% B; 88~90 min ,5% B ; 流速0.3 mL/min,柱温35 ℃,进样量5 μL。

飞行时间质谱仪仪器参数:ESI 离子源,电喷雾正离子模式,离子源电压5500 V,离子源温度550 ℃,雾化气55 psi,辅助气55 psi,气帘气35 psi,去簇电压100 V,碰撞能量35 eV,能量扩展±15 eV,TOF-MS 扫描范围50~1200 Da,Product Ion 扫描范围50~1000 Da。扫描方式为IDA 模式。

1.3 数据处理

采取靶向检索与非靶向检索相结合策略。

靶向检索:通过查询文献,建立PPECs 组分列表,包括英文名称、CAS 号、分子结构式、分子量、二级碎片离子质荷比(m/z)等信息。将样品数据导入PeakView 软件进行检索,依据测定的精确质量数与理论的精确质量数的偏差小于5 mmol/L 的原则以及同位素分布模式,确定各色谱峰的成分归属,根据二级碎片离子信息推断各色谱峰所对应未知物的结构,并与文献报道进行比对从而进一步确证结构。

非靶向检索:样品数据导入PeakView 软件进行非靶向检索,如果色谱峰的精确质量数与同位素偏差均小于5 mmol/L,母离子m/z 大于400,碎裂反應时以脱水、脱羰基等中性丢失为主要形式,且二级碎片离子中具有m/z 为91、107、121、137、164、192、227、239、255、267、283、301等特征离子,则初步判定该未知物属于PPECs。采用Formula Finder 程序推测未知物分子式,并基于PPECs 的质谱裂解规律以及二级质谱碎片信息,推断PPECs 中2-(2-苯乙基)色酮结构单元的类型和结合方式,以及取代基类型与位置,初步确定PPECs 的结构。绘制PPECs 结构式并将其导入PeakView 软件,通过Frangment Pane 程序计算理论二级碎片与实际二级碎片之间的匹配度,从而确定PPECs 结构,并与文献报道进行比对从而进一步确证结构。

2 结果与分析

2.1 PPECs 鉴定结果

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析沉香PPECs,在正离子模式下进行一级及二级质谱数据采集,获得各未知物的保留时间、准分子离子峰及MS/MS 碎片离子的精确相对分子质量。共鉴定出PPECs 成分55 個,其中44 个DPECs、3 个TPECs 和8 个SPECs。DPECs 组分最为丰富,在总PPECs 中所占比例最高,达到80%;其次是SPECs(14.5%);TPECs 组分最少,仅为5.5%。相关成分的质谱信息列于表1,结构见图1~图3。

2.2 质谱裂解规律分析

2.2.1 色酮二聚物(DPECs) 沉香样品中共鉴定出44 个DPECs 成分,分别是化合物1~17、19~31、33、35、36、40~47 和48~50(表1,图1)。图1 表明,DPECs 的结构单元之间的连接方式具有差异性,根据2-(2-苯乙基)色酮单元之间连接方式的不同,44 个DPECs 成分分为4 种类型,A 型DPECs 的结构单元之间通过C-C 键相连,如化合物50;B 型DPECs 结构单元之间通过C-O-C 键相连,如化合物1、2、3、6、7 等;C 型DPECs 结构单元之间通过2 个C-O-C 键相连,如化合物3、4、5、36 等;D 型DPECs 其结构单元之间通过C-C 键和C-O-C 键相连,如化合物28、42、44~46。

DPECs 的质谱裂解具有较强的规律性,如常见的有脱水([M+H-18])、脱羧([M+H-44])、脱羰基([M+H-28]+)、碳碳键(C-C)断裂等[5, 11, 17],这些规律是对DPECs 进行结构分析的重要依据。序号20、25、27 和41 的色谱峰其母离子具有相同的质荷比(m/z)和相同的分子式,鉴定为AH15及其同分异构体,它们的二级质谱图与可能的质谱裂解途径见图4 和图5。色谱峰20 母离子([M+H])m/z 为583.1986,连续2 次失去水分子分别产生碎片m/z 565.1865([M+H-18])和m/z 547.1758([M+H-36]),m/z 547.1758 丢失羰基则产生碎片m/z 519.1807([M+H-36-28]+),m/z519.1807 丢失苯环则产生碎片m/z 441.1330([M+H-36-28-78])。其次,m/z 583.1986 的C-O-C键发生断裂,断裂产物随后发生脱水反应,生成碎片m/z 301.1078,m/z 301.1078 失去一分子水产生碎片m/z 283.0966,m/z 283.0966 脱去一分子羰基生成碎片m/z 255.1008,脱去一分子CO 则生成m/z 239.1049,m/z 283.0966 的色酮环与苯环之间C7′、C8′处的C-C 键受到电子轰击而断裂,生成碎片m/z 192.0398 和m/z 91.0525。根据以上分析,推测该未知物是AH15,即沉香四醇与6,7-二羟基-2-(2-苯乙基)色酮通过C-O-C 键相连形成的色酮二聚物。

同理,通过对其他色谱峰二级碎片等信息进行分析,确定了共44 种DPECs 化合物的结构(图1)。其中9 个DPECs 化合物尚无文献报道,即化合物1、7~11、13、14 和21,是潜在的新化合物。鉴定出分子式相同的一组同分异构体,但是无法确定结构中各取代基的空间朝向。

本研究从沉香样品中鉴定的PPECs 组分普遍具有同分异构体,如AH13、AH15 各有4 个同分异构体,AH21、dehydroxy AH21、AH12 等各有2 个同分异构体。据LI 等[5]报道,沉香PPECs 同分异构体丰富,如,AH15 同分异构体多达13 个,AH21 同分异构体有7 个,hydroxyl AH11、AH12、AH13 则各有6 个同分异构体。PPECs 结构中含有色酮环,环上的氢原子、羟基、甲氧基等取代基的取代位置不同和化学键空间朝向不同是同分异构体丰富的主要来源。具有相同分子式的一组同分异构体的共同特征是质谱二级碎片大多相同,但保留时间不同。液相色谱-飞行时间质谱能鉴定出分子式相同的一组同分异构体,但是无法确定结构中各取代基的空间朝向。

2.2.2 色酮三聚物(TPECs) 从沉香样品中共鉴定出3 个TPECs 组分,分别是化合物34、38、54(图1),其中化合物34、38 为同分异构体。化合物54 的二级质谱图与质谱裂解途径见图6 和图7,母离子([M+H]+)m/z 815.2865,失去一分子水生成碎片m/z 797.3320([M+H-18]+),化合物54 结构中的C-O-C 键发生断裂,生成2 个碎片m/z 267.1019 和m/z 567.2241,m/z 567.2241 脱去一分子水生成碎片m/z 549.1916,m/z 549.1916继续脱水产生碎片m/z 531.1816,m/z 531.1816 中的酯键发生断裂产生m/z 283.0969,m/z 283.0969脱去一分子CO 则生成m/z 239.1065。根据质谱裂解规律,推测化合物54 是由沉香四醇与两分子5-羟基-2-(2-苯乙基)色酮通过C-O-C 键相连形成的色酮三聚物。化合物54 目前尚无文献报道,推测为新化合物。

2.2.3 萜类-色酮二聚物(SPECs) 总共鉴定出8 个SPECs 组分,分别是化合物18、32、37、39、51、52、53 和55。4 个化合物(32、39、51 和52)被鉴定为aquilacrassnin A 及其同分异构体。化合物32 的二级质谱图与质谱裂解途径见图8 和图9。化合物32 母离子([M+H])m/z 535.2691,失去一分子水生成碎片m/z 517.2596([M+H-18]),再失去一分子水生成碎片m/z 499.2468([M+H-36])。母离子结构中的酯健发生断裂,生成2 个碎片m/z235.1678 和m/z 319.1194,m/z 319.1194 脱去一分子水生成碎片m/z 301.1054,m/z 301.1054 继续脱水产生碎片m/z 283.0957,m/z 283.0957 中脱去苯甲基则生成m/z 192.0397。m/z 235.1678 脱去一分子水生成碎片m/z 217.1574,m/z 217.1574 脱去一分子羰基生成碎片m/z 189.1611。根据以上分析,推断化合物32 为aquilacrassnin A,是沉香四醇与芹子-4,11-二烯-14-油酸(selina-4,11-dien-14-oicacid)通过酯键相连形成的二聚物。

3 讨论

沉香2-(2-苯乙基)色酮类化合物种类丰富,但是同分异构体与立体异构体众多,质谱规律呈现出多样性与复杂性,质谱解析难度大。PPECs 的裂解规律与2-(2-苯乙基)色酮单元裂解规律相似,受到电子轰击时往往先脱去一分子或多分子水,或脱羰基,然后色酮单元之间的化学键发生断裂,生成2~3 个相应的色酮单元或脱水、脱羰基后的色酮单元,并在此基础上进一步发生碎裂反应,例如色酮单元中连接色酮环和苯环的C7′、C8′处的C-C 键发生断裂,形成色酮离子碎片和苯甲基离子碎片,以及色酮环上发生进一步脱水、脱羰基。

本研究采用超高效液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱对沉香药材中PPECs 进行分析,探讨了PPECs 成分的质谱裂解规律。共鉴定出55 个PPECs 成分, 包括2-(2- 苯乙基) 色酮二聚物(DPECs)44 个,三聚物(TPECs)3 个,萜类-2-(2-苯乙基)色酮二聚物(SPECs)8 个,其中9 个DPECs、1 个TPECs 和1 个SPECs 首次在沉香中被发现。其次,沉香PPECs 的部分组分具有2~4个同分异构体。以上结果表明,沉香药材中的PPECs 组分及其同分异构体丰富,且DPECs 类型的组分在总PPECs 中所占比例最高(80%)。研究结果为沉香药效物质基础研究及开发利用奠定基础,为沉香药材的现代化与标准化提供依据。

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