林则徐戒烟方对地西泮自然戒断小鼠的治疗作用及初步机制研究

焦 玥 李 鹏 刘艳骄 赵小亮 刘 洋 李 涛 王志国 王丹巧

(1 中国中医科学院医学实验中心,北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室,北京,100700; 2 北京市海淀区玉渊潭社区卫生服务中心,北京,100363; 3 中国中医科学院广安门医院心理睡眠科,北京,100032)

林则徐戒烟方(以下简称戒烟方),也称为林文忠公戒烟方,来源于福州林则徐纪念馆,是林则徐和名医何其伟合作研制,以解清末鸦片泛滥之毒。道光十八年林则徐任湖广总督时,即将该方上奏朝廷[3]。该方主方名“忌酸丸”,辅佐方名“补正丸”。《湖广奏稿》卷四中记载该方在湖广地区“凡省城、汉镇药店,所配戒烟之药,无家不有,无日不售”,并“有耆民妇女在路旁叩头称谢,据云其夫男久患烟瘾,今幸服药断绝,身体渐强”。中国中医科学院广安门医院刘艳骄教授[4]借鉴林则徐戒除鸦片的思路,采用戒烟方作为安眠药物中药替代治疗的主要方剂,并提出安眠药物依赖性失眠的中医病因是“毒邪滞留,内生燥火”,病机为“毒邪上脑”,全方以西洋参、当归、黄芪等扶正,黄连、天麻、柴胡、沉香等解毒,共奏“温补脾肾,益气升阳,滋阴平肝,治药毒瘾”之效,在临床上收到良好的治疗效果,形成规范化诊疗流程[5],但戒烟方的作用机制尚无研究。由于长期滥用药物会使大脑产生适应性改变,主要表现为脑内多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)等与奖赏系统有关的神经递质改变,神经营养因子释放,突触可塑性改变等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与药物成瘾引起的神经适应性和奖赏效应直接相关[6]。因此,本研究模拟临床停药过程,采用小鼠规律灌胃地西泮28 d后停止给药的自然戒断方法,观察戒烟方对小鼠在戒断3 d后发生的行为学变化、纹状体内多种神经递质的改变以及对脑源性神经营养因子(BDNF)、mTOR活性的影响,探讨戒烟方治疗地西泮自然戒断的治疗作用及其相关机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性KM小鼠40只,体质量20 g左右。购于北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证编号:SCXK(京)2019-0008。所有动物饲养于独立通气笼具(461 mm×274 mm×229 mm),实验室环境温度为22 ℃左右,湿度为50%左右,提前喂养1周适应饲养环境,自由饮水和食用商业饲料。动物实验伦理审批号:ERCCACMS21-2303-05。

1.1.2 药物 地西泮片(山东信谊有限公司,国药准字H37023039),戒烟方药物组成:西洋参15 g、麸炒白术10 g、生黄芪10 g、柴胡15 g、当归6 g、关黄柏12 g、木香6 g、陈皮6 g、升麻5 g、天麻6 g、甘草6 g、沉香6 g。中药购自北京同仁堂有限公司。

1.1.3 试剂与仪器 DA(批号:BCBC7614V)、3,4二羟基苯乙酸(DOPAC,批号:0001364209)、5-羟色胺(5-HT,批号:091M1128V)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA,批号:046K1520)、氯化钾(批号:080M0091V)、乙二胺四乙酸二钠(批号:080M0013V)均为Sigma公司(美国)产品。辛烷磺酸钠(批号:7876976)、磷酸二氢钠(批号:2461229)、磷酸(批号:4103512)、四氢呋喃(批号:R141892)、甲醇(批号:R142188)、乙腈(批号:R142091)均为Dikma公司产品(北京迪科马科技有限公司)。Glu(批号:060M01711V)、甘氨酸(Gly,批号:1394031V)、牛磺酸(Tau,批号:71K0130)、GABA(批号:124H0364)、邻苯二甲醛(批号:BCBL2514V)、乙酸钠(批号:5043R28V)均购于Alfa Aesar(China)Chemicals公司(美国)。BDNF抗体(批号:GR3319825-22)、mTOR抗体(批号:GR3356299-18)购自Abcom公司(英国),p-mTOR抗体(批号:28273-1-AP)购自Proteintech公司。电动组织研磨器(GINGKO公司,型号:G12402031),多管涡旋震荡仪(TARGAIN,北京锦踏科技有限公司),Rotanta 460R离心机(Andreas Hettich GmbH&Co.KG,德国)。高效液相-电化学检测系统:Sykam高效液相色谱仪,包括S2100溶剂输送系统,S5200自动进样器和Clarity色谱工作站[Sykam(赛卡姆)公司,德国]。Antec Decade Ⅱ SDC电化学检测器,VT-03玻璃碳工作电极(直径3 mm),原位银/氯化银参比电极,25 μm电极垫片,柱前连有ADF滤波器(0.05 Hz)和脉冲阻尼器(Antec Leyden BV公司,荷兰)。Waters X Select@HSS T3色谱柱(2.5 μm,2.1 mm×50 mm)(Waters公司,美国)。高效液相-荧光检测系统包括:Aglient 1260 InfinityⅡ高效液相色谱系统,包括自动进样器、四元泵、柱温箱、荧光检测器和Openlab软件。Aglient Eclipse AAA色谱柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),以上均为Agilent科技有限公司产品(美国)。稳压稳流电泳仪(型号:Powerpac HQ),垂直电泳槽(型号:MP3)、半干转电转印仪(型号:Trans-Blot SD)均为Bio-Rad公司产品(美国)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只小鼠称量体质量后按照随机数字表法分为5组:正常对照组、模型组、戒烟方低剂量组、戒烟方中剂量组、戒烟方高剂量组。正常对照组小鼠灌胃蒸馏水28 d。其余各组小鼠连续灌胃地西泮(2 mg/kg)28 d。

1.2.2 干预方法

1.2.2.1 林则徐戒烟方的制备方法 按照临床每人每日用量折算小鼠每日使用的等效剂量。戒烟方药材(西洋参另煎兑入)浸泡2 h后大火烧开,小火煎煮后提取2次。所有药汁混合后浓缩,移入旋蒸仪旋转蒸发至所需31.0 g/kg。分装,-80 ℃保存。

1.2.2.2 给药方法 造模后停药3 d。在此期间,模型组和正常对照组灌胃蒸馏水;戒烟方低剂量组(7.8 g/kg)、戒烟方中剂量组(15.5 g/kg)、戒烟方高剂量组(31.0 g/kg)灌胃相应剂量的中药。

1.2.3 检测指标与方法

记录每组小鼠每天总的饮食、饮水量。3 d后记录每只小鼠体质量,进行行为学检测。小鼠脱颈处死后剥离脑组织取纹状体,精密称取纹状体质量,-80 ℃保存。

1.2.3.1 行为学分析 应用旷场实验分析小鼠的行为学变化。将小鼠放入50 cm×50 cm的旷场中。底部平均分为25个正方形格子。将与旷场箱壁相连的方格或者区域称为周围格,不与反应箱壁连接的区域称为中央格。每次将小鼠放正中格子中,观察记录5 min内小鼠穿过中央格和外周格的数量。穿过格子以小鼠半身以上进入格子记为1个。记录小鼠直立和梳理的次数。直立以小鼠前肢全部离开地面记为1次。梳理以小鼠完成整套梳理毛发过程记为1次。每只小鼠记录完毕后喷洒乙醇挥干以减少对随后记录动物的干扰。

1.2.3.2 高效液相-电化学方法检测小鼠纹状体中单胺类神经递质的含量 将纹状体加入适量冷生理盐水用手持式匀浆器在冰上进行匀浆,取定量匀浆液加入3倍体积的1%甲酸-乙腈,震荡3 min后离心(离心半径97 mm),20 000×g,4 ℃,离心5 min。取上清液加入等体积1%高氯酸后重复上述步骤,以同样条件再次离心取上清液。样本适量稀释后即进行检测,避免反复冻融。流动相为水∶甲醇=90∶10(含0.74 mmol/L辛烷磺酸钠、80 mmol/L二水合磷酸二氢钠、0.027 mmol/L乙二胺四乙酸二钠和2 mmol/L氯化钾),磷酸调pH=3.0,0.2 mL/min等度洗脱,柱温35 ℃。所得数据根据稀释倍数和组织质量进行浓度校正。检测DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA的含量。

1.2.3.3 高效液相-荧光法检测小鼠纹状体中氨基酸类神经递质的含量 将纹状体加入适量冷生理盐水用手持式匀浆器在冰上进行匀浆。取定量匀浆液加入3倍乙腈,震荡3 min后离心(离心半径97 mm),20 000 g,4 ℃,离心5 min。取上清液以同样条件再次离心。样本适量稀释后即进行检测,避免反复冻融。流动相、衍生液配制等参见文献[7]。二元梯度洗脱,流速0.8 mL/min;激发波长340 nm,发射波长455 nm。所得数据根据稀释倍数和组织质量进行校正。检测Glu、GABA、Tau、Gly含量。

1.2.3.4 Western blotting方法检测纹状体中BDNF及mTOR和p-mTOR蛋白表达 将纹状体组织放入预冷的研钵中加入液氮进行快速研磨提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度。Western blotting操作流程包括电泳、蛋白质的电转移和膜封闭、抗原抗体反应及显影,用IPP软件对扫描图像的目的条带进行灰度分析。抗体稀释倍数1∶1 000。

2 结果

2.1 地西泮停药3 d小鼠体质量、饮食、饮水量变化 小鼠灌胃28 d后,正常对照组与其余各组灌胃地西泮小鼠的平均体质量没有差异。戒断3 d后,每只小鼠的体质量按每日体质量减去戒断前体质量得到的差值进行统计。与正常对照组比较,3 d后各组小鼠与戒断前体质量增值明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),戒烟方低、中、高剂量组体质量增值与模型组比较有升高趋势。连续观察各组小鼠在这3 d内的平均饮食量和饮水量可以看到,模型组小鼠在第1天出现饮食量下降、饮水量增多的表现,在随后2 d内逐渐恢复。戒烟方低、中、高剂量组对于饮食量降低有一定的改善作用。见图1,表1。

图1 戒断3 d后各组小鼠的体质量增值(n=8)

2.2 各组小鼠行为学结果 戒断3 d后进行旷场实验,记录小鼠穿过周围格次数以及穿过中央格次数。与正常对照组比较,模型组小鼠穿过中央格(P<0.05)和周围格数量均减少,小鼠表现出探索欲望下降,运动减少。戒断3 d中给予戒烟方治疗,对于周围格运动的降低没有明显改善,但戒烟方高剂量组小鼠穿过中央格的数量显著增加(P<0.05),说明戒烟方对于小鼠探索兴趣和运动有一定的提升作用。戒烟方低、中、高剂量组对于小鼠直立次数的减少有增高趋势,对于小鼠自我梳理次数减少没有影响。见图2。

图2 戒烟方对地西泮自然戒断小鼠行为学影响(n=8)

2.3 戒烟方各组对于地西泮自然戒断后小鼠纹状体内单胺类神经递质的影响 与正常对照组比较,模型组中DA及其代谢产物DOPAC、HVA显著降低(P<0.05或P<0.01),戒烟方对于DA的降低具有升高作用,戒烟方高剂量组显著提高DA水平(P<0.05)。模型组5-HT也明显降低(P<0.05),戒烟方高剂量组显著提高了5-HT的含量(P<0.05),5-HT的代谢产物5-HIAA含量略有降低。以上结果说明,地西泮自然戒断状态下模型小鼠脑纹状体中DA、5-HT及其部分代谢产物发生明显变化,戒烟方对于DA、5-HT的下降有升高作用,而且没有增加代谢产物含量,说明对脑内起到直接作用的DA和5-HT没有快速降解,可以维持较高的脑内浓度。见表2。

2.4 戒烟方对于地西泮自然戒断后小鼠纹状体内氨基酸类神经递质的影响 与正常对照组比较,模型组纹状体中兴奋性Glu水平降低,抑制性GABA水平升高趋势,导致Glu/GABA比值明显下降(P<0.05),戒烟方高剂量组可以明显抑制Glu/GABA的下降(P<0.01)。模型组Tau水平明显下降(P<0.05),戒烟方有升高Tau趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。戒烟方对于纹状体中Gly水平没有明显影响。以上结果说明,地西泮自然戒断状态下模型小鼠脑内已经出现兴奋性和抑制性神经递质失衡,戒烟方对于Glu/GABA失衡具有明显的调节作用。见表3。

表3 戒烟方对于地西泮自然戒断小鼠脑内氨基酸类神经递质的影响

2.5 戒烟方对地西泮自然戒断小鼠纹状体p-mTOR、mTOR和BDNF蛋白表达的影响 与正常对照组比较,模型组p-mTOR/mTOR和BDNF表达明显降低(P<0.05或P<0.01),戒烟方有提高p-mTOR/mTOR的作用(P<0.05)和增加BDNF表达的趋势。见图3。

3 讨论

BZDs药物主要通过作用于γ-氨基丁酸A型(GABAA)受体复合物的苯二氮类(BZD)受体起到镇静、安眠作用,但由于受体的非选择性,长期使用容易造成药物依赖,撤药症状明显。长期服用产生耐受性后,可在同品种之间存在交叉耐受和交叉依赖。目前,尚没有药物被推荐或批准用于治疗BZDs药物依赖或促进长期使用后的戒断,主要以逐渐减量及对症给药为主,但药物使用的结果差异很大,这使BZDs依赖已经成为困扰健康状况的公共卫生问题和社会问题[8]。

中医学认为药物依赖多为“毒邪入脑”。所用中药多为多靶点无成瘾性药物,在治疗药物依赖方面具有较大优势。林则徐戒烟方由西洋参、生黄芪、当归、柴胡、麸炒白术、关黄柏、木香、陈皮、升麻、天麻、沉香和甘草组成。方中西洋参、黄芪、当归、甘草是历代戒烟方中的常用药物。现代药理研究认为中药主要以靶标脑部DA能和Glu能系统,通过调节神经递质的合成与释放、影响突触可塑性等功能调节脑内微环境稳态,起到“解毒”作用[9]。在我们的前期研究中,观察地西泮给药戒断后纹状体、下丘脑、皮层、中脑和海马中的多种神经递质发生改变。已知纹状体是基底神经节环路信号的传入及整合中心,接受来自皮层、下丘脑、中脑的信号传入,经过局部环路再传出到苍白球或者黑质网状部,参与药物成瘾的从初始暴露到复吸的所有阶段[10]。

本研究中,小鼠在长期给予地西泮后戒断3 d,发现明显影响小鼠饮食饮水,造成其体质量增长低于正常小鼠;行为学检测发现穿过中央格数量减少,直立探索次数降低,说明小鼠的探索及运动的欲望降低,出现类似焦虑、抑郁样情绪变化,而戒烟方明显改善了小鼠的一般状态及运动和探索兴趣,从整体上说明药物的有效性。

本研究中,慢性给药戒断小鼠纹状体DA、5-HT及其代谢产物DOPAC、HVA等模型组明显降低。已知脑内多巴胺能神经系统的改变是药物依赖的标志性特征,而5-HT与情绪改变密切相关。有研究表明,BZDs药物引起的焦虑患者血液中DA、5-HT明显降低。不同剂量的地西泮,短期和长期处理斑马鱼后可以引起5-HT、DA等多种神经递质浓度随时间发生改变,早期明显升高,长期则引起部分神经递质显著下降,说明神经递质在不同病理阶段处于动态变化的过程[11]。戒烟方对于地西泮长期给药引起的DA、5-HT降低有明显的升高,而对于代谢产物的影响不明显,说明戒烟方可能对于脑内DA、5-HT的生成有促进,或是对于其降解可能有抑制作用,从而使脑内神经递质恢复且维持在较高水平,进而缓解药物戒断引起的不良反应。

BZDs通过结合和增强GABA受体发挥作用,本研究中,虽然没有观察长期给药后GABA的改变,但是在戒断3 d后,GABA含量仍然高于正常对照组,同时抑制性氨基酸Gly具有同样趋势变化,兴奋性神经递质Glu则相对正常对照组降低,Glu/GABA降低显著,说明戒断3 d后小鼠纹状体中仍然以抑制性变化占据优势,尤其是戒烟方高剂量组改善了纹状体的抑制状态,与行为学表现相符。已知Tau有明确的抗焦虑和抗抑郁作用,可以明显提升急性或者慢性不可预知温和应激(CUMS)致抑郁小鼠脑组织中DA、5-HT含量,降低单胺氧化酶活性,升高脑内BDNF含量[12]。Tau在模型小鼠脑中明显降低。戒烟方则升高纹状体中Tau含量,有益于改善小鼠的抑郁状态。以上结果表明,戒烟方改善小鼠的运动和探索能力与调节纹状体内多种神经递质失衡有关。

长期灌胃地西泮的小鼠纹状体出现BDNF表达降低、p-mTOR/mTOR降低的现象。甲基苯丙胺成瘾者戒断阶段外周血中BDNF随戒断时间而逐渐降低,如果伴有抑郁症状则BDNF下降更多,而抑郁会明显增加甲基苯丙胺复吸的概率[13]。

戒烟方在清末戒烟运动中发挥了重要作用,如今古方新用,在临床治疗安眠药物依赖也取得了良好的治疗效果。本研究中,我们以小鼠地西泮长期给药后戒断模拟安眠药依赖,发现其改善小鼠行为的作用机制与调节脑内多种神经递质稳态密切相关,由于受组织样本量所限未进行神经递质代谢酶等相关检测,此部分工作进行将会继续开展,以期更好地揭示戒烟方对于药物依赖治疗作用机制,为戒烟方临床治疗和药理机制提供新的依据。

利益冲突声明:无。