臭氧处理对冬枣贮藏品质的影响

彭旭阳，董成虎，赵晓梅，纪海鹏，苗云刚，张婷，胡云峰*，缴秋祥

（1.天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457；2.国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；3.新疆农业科学院园艺作物研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；4.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆 乌鲁木齐 830091；5.山东华旭包装制品有限公司，山东 淄博 370300；6.梁山县科技创新服务中心，山东 济宁 272600）

冬枣属鼠李科植物，因果实多在10 月下旬成熟故称其为冬枣[1]，或称为冻枣、冰糖枣等。冬枣果肉脆嫩，汁水饱满，味道甘甜，有独特的香味，富含多种人体所需氨基酸和维生素，其中维生素C 的含量比苹果高70 倍，比梨高100 倍。此外，冬枣中的维生素B 族对安神和提高睡眠质量有着显著功效，因此备受消费者喜爱[2]。冬枣在运输和采摘过程中易出现机械损伤，由于枣属非呼吸跃变型水果，采后在常温条件下会迅速成熟，出现失水萎蔫、果肉软化、果皮褐变、逐渐酒化和腐烂变质等现象[3]，这极大地限制了冬枣的贮藏性和市场价值。

目前，冬枣常见的保鲜方式有低温保鲜[4]、气调保鲜[5]、1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）保鲜[6]、ClO2熏蒸保鲜[7]、涂膜保鲜[8]等。臭氧（O3）是一种具有特殊气味的不稳定气体，在水和空气中会逐渐分解为氧气，无残留，安全无公害，其强氧化性能破坏微生物细胞结构从而使细胞丧失物质交换功能，能杀灭致病菌、抑制孢子的萌发从而延长冬枣的货架期[9]。臭氧处理作为新兴的物理保鲜技术已应用于香椿[10]、苹果[11]、哈密瓜[12]、葡萄[13]等食品保鲜加工领域，具有较好的保鲜效果，但其在冬枣保鲜上的研究报道较少。

本文以冬枣为试验材料，采用不同臭氧浓度（0、2.14、10.72、21.44 mg/m3）处理冬枣，探索臭氧对冬枣生理品质及其抗氧化能力的影响，筛选臭氧处理的适宜浓度，提高冬枣的商业应用价值，为冬枣采后大规模贮藏提供相关技术支撑和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冬枣：采摘于山东沾化冬枣基地，采摘后放置于泡沫箱中，当天运至国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），挑选无病虫害、大小均匀、无机械伤、果实饱满的冬枣为试验材料。

冰醋酸、30%过氧化氢：天津市光复科技发展有限公司；愈创木酚、酚酞：天津市天新精细化工开发中心；聚乙烯吡络烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、对氨基苯磺酸、α-萘胺、盐酸羟胺、氢氧化钠、抗坏血酸、Triton X-100、聚乙二醇：天津市大茂化学试剂厂；草酸、硫代巴比妥酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA）：天津市江天统一科技有限公司；过氧化氢试剂盒：南京建成生物工程研究所。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CA-10CO2分析仪、TA-XT Plus 物性测定仪：美国Stable Micro System 公司；CPR-G6 臭氧气体检测探头：北京康尔兴科技发展有限公司；PAL-1 数字手持式折射仪：日本ATAGO 公司；D-37520 高速冷冻离心机：德国Eppendorf 公司；UV-1780 紫外可见分光光度计：日本岛津公司；DZS-708 雷磁多参数分析仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；SynergyH1 酶标仪：美国伯腾公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验处理

精选后的冬枣果实使用微孔膜进行分装，2.50 kg为一袋，6 袋为一组，随机分为4 组，共装24 袋。放置于（0.00±0.50）℃、湿度为80%～90%的冷库中进行预冷24 h。

试验设置不同臭氧浓度处理冬枣，放入国家农产品保鲜工程研究中心（天津）研制的臭氧精密控制熏蒸装置中。分组设定为对照组（CK）：不进行任何处理；T1 组：2.14 mg/m3臭氧处理；T2 组：10.72 mg/m3臭氧处理；T3 组：21.44 mg/m3臭氧处理。每7 d 处理1 次，每次熏蒸1 h，每隔14 d 取样进行指标测定。

1.3.2 试验指标与测定方法

1.3.2.1 可溶性固形物（total soluble solids，TSS）含量测定

每个处理中随机选取5 个冬枣果实，打碎成浆，用纱布过滤取汁，采用数字手持式折射仪进行测定，每次测定重复3 次。TSS 含量单位为%。

1.3.2.2 硬度测定

每个处理随机选取10 个以上果实，选取冬枣赤道对称部位使用物性测定仪进行硬度测定。设定运行参数：穿刺深度5 mm，测前速率5 mm/s，测试速率2 mm/s，测后速率5 mm/s，使用P/2 柱头（Φ=2 mm）单位以kg/cm2计。

1.3.2.3 超氧阴离子自由基（·O2-）释放速率测定

参考曹建康等[14]的方法略有改动。称取3 g 研磨后的样品，以1 ∶1 体积比加提取缓冲液（1 mmol/L EDTA、0.3% Triton X-100 和2%PVP），10 000 r/min 离心20 min 后取上清液。以1 ∶1 ∶1 体积比在试管中加入上清液、磷酸缓冲液、盐酸羟胺溶液，25 ℃保温1 h 后，加入对氨基苯磺酸溶液与α-萘胺溶液进行显色反应，于530nm 处测定OD 值，重复3 次。单位以nmol/（min·g）计。

1.3.2.4 过氧化氢（H2O2）含量测定

采用H2O2试剂盒（分光光度法）：准确称取研磨好的冬枣样品1 g，加入9 mL 磷酸缓冲液，超声辅助提取2 min，10 000 r/min 离心20 min 后取上清液，根据试剂盒说明书进行加样操作，于405 nm 处测定OD 值，计算样品中H2O2含量。单位以μmol/g 计。

1.3.2.5 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定

参考Li 等[15]的方法，称取1 g 加入5 倍体积的三氯乙酸溶液，5 000 r/min 离心15 min 后收集上清液。以1 ∶2 体积比加入上清液和硫代巴比妥酸于试管中，加上棉塞后置于沸水浴中20 min，分别测定上清液在450、532、600 nm 处的OD 值（分别记为A1、A2、A3）。样品中MDA 含量（C，μmol/g）计算公式如下。

式中：C1为反应液中MDA 浓度，μmol/L；V 为样品提取液总体积，mL；m 为样品质量，g。

1.3.2.6 抗坏血酸（VC）含量测定

采用钼蓝比色法测定样品中VC含量[16]，略有改动。称取冬枣3 g，加入适量草酸-EDTA 溶液，经搅碎后转入100 mL 容量瓶中定容、过滤。吸取上清液10 mL 于50 mL 容量瓶中，加入偏磷酸-醋酸溶液1 mL、5%硫酸溶液2 mL 和5%钼酸铵溶液4 mL，以蒸馏水定容，摇匀，于波长709 nm 处测定吸光度。单位以mg/100 g表示。

1.3.2.7 抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性的测定

参考曹建康等[14]的方法，将2 g 样品和5 mL 经预冷的提取缓冲液（0.1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 抗坏血酸和2%PVP）混匀后10 000 r/min 离心15 min，上清液为APX 提取液，于290 nm 波长下记录反应体系的OD值，每15 s 记一次，连续测定6 个点，重复3 次。以每克果蔬样品每分钟吸光度减小0.01 为1 个APX 活性单位U。

1.3.2.8 过氧化物酶（peroxidase，POD）活性的测定

参考曹建康等[14]的方法，将5 g 样品和5 mL 经预冷的提取缓冲液（1 mmol/L 聚乙二醇、4%PVP 和1%Triton X-100）混匀后10 000 r/min 离心20 min，上清液为POD 提取液。在酶标板孔中加入0.20 mL 25 mmol/L愈创木酚、0.02 mL 0.50 mol/L H2O2以及0.05 mL 的酶液，连续测定5 min 反应混合物的吸光度。以每克果蔬样品每分钟吸光度减小0.01 为1 个POD 活性单位U。

1.4 数据处理

使用Excel 2016 对试验数据进行整理，使用Origin 2021 进行数据分析及作图，每次试验进行3 次重复，以SPSS 22 用于显著性分析，以P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度臭氧处理对冬枣TSS 含量的影响

TSS 含量是反映果实中主要营养物质多少的重要指标。不同浓度臭氧处理对冬枣TSS 含量的影响见图1。

图1 不同浓度臭氧处理对于冬枣TSS 含量的影响Fig.1 Effect of ozone treatment with different concentrations on the TSS content in winter jujubes

从图1 可以看出，随贮藏时间延长TSS 含量呈现先上升后下降的趋势。主要是由于冬枣的后熟作用，导致其TSS 含量不断积累，到达峰值之后又因果实的呼吸作用消耗了果实中的TSS[17]。果实成熟过程中产生的乙烯被臭氧分解成二氧化碳和水，推迟了果实的成熟进程[18]。贮藏42 d 时，CK 组TSS 含量为13.93%，显著低于臭氧处理组（P＜0.05），T1、T2、T3 组TSS 含量分别为16.60%、15.17%、14.63%，且贮藏42 d 后，CK组的TSS 含量始终低于臭氧处理组。这表明，通过在一定贮藏期内适宜的臭氧浓度处理，可以有效抑制冬枣中可溶性固形物含量的下降，其中T1 处理组的效果较好。

2.2 不同浓度臭氧处理对冬枣硬度的影响

硬度代表果品在受压时所承受的抗力，采后果蔬硬度变化是限制果蔬货架期的重要因素之一[19]。不同浓度臭氧处理对冬枣硬度的影响见图2。

图2 不同浓度臭氧处理对于冬枣硬度的影响Fig.2 Effect of ozone treatment with different concentrations on the hardness of winter jujubes

从图2 可以看出，各处理组果实硬度均随贮藏时间延长呈下降趋势，CK 组硬度值下降最多，由开始的4.47 kg/cm2降为最终的1.80 kg/cm2。贮藏28 d 时，与CK 组相比，T1、T2 和T3 组果实硬度较高（P＜0.05）。可能是臭氧抑制了乙烯产生并通过抑制MdPME 和MdPG1基因的表达来抑制多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶等的活性，延缓细胞壁降解，使果实维持较好的硬度[20]。以上结果表明臭氧处理可有效延缓冬枣果实的硬度下降。

2.3 不同浓度臭氧处理对冬枣超氧阴离子自由基（·O2-）释放速率的影响

超氧阴离子是细胞中毒性最强的自由基，其大量产生会导致植物细胞发生毒害甚至死亡[21]。不同臭氧处理对于冬枣·O2-释放速率的影响见图3。

图3 不同浓度臭氧处理对于冬枣超氧阴离子自由基释放速率的影响Fig.3 Effect of ozone treatment with different concentrations on the release rate of superoxide anion radical from winter jujubes

从图3 中可以看出，贮藏期内CK 组的·O2-释放速率显著高于T1、T2 和T3 处理组（P＜0.05），在贮藏84 d时，CK、T1、T2、T3 组·O2-释放速率分别为2 082.81、1 091.60、1 708.99、1 882.21 nmol/（min·g），分别是初始值的260.13%、136.45%、213.32%、235.04%。并且整个贮藏期内T1 处理组·O2-释放速率变化较为平缓。在贮藏70～84 d 时·O2-释放速率突然升高，可能是因为贮藏后期，果实遭受逆境胁迫及衰老而产生大量活性氧的现象[22]。综上，臭氧处理可以显著抑制·O2-的释放速率，其中T1 组抑制·O2-释放速率效果较好。

2.4 不同浓度臭氧处理对冬枣H2O2 含量的影响

过氧化氢是活性氧系统的重要组成部分，生物、非生物胁迫以及激素信号等均可刺激植物细胞产生和积累H2O2[23]。但是过高的H2O2浓度超过植物本身的中和能力时，会引起氧化应激，从而导致果蔬脂质和蛋白质的氧化以及细胞膜的损伤[24]。不同浓度臭氧处理对冬枣H2O2含量的影响见图4。

图4 不同浓度臭氧处理对冬枣H2O2 含量的影响Fig.4 Effect of ozone treatment with different concentrations on the H2O2 content in winter jujubes

从图4 中可以看出，冬枣的整个贮藏期内H2O2含量随贮藏时间延长总体呈上升趋势，与CK 组相比，臭氧处理组均减缓了H2O2的积累。在0～14 d 内CK 组呈现明显上升趋势，而臭氧处理组的H2O2含量具有降低趋势，其原因可能是臭氧影响了冬枣中与H2O2清除有关的POD 和APX 的活性[25]，使冬枣中H2O2产生速率小于H2O2清除速率，从而减少了H2O2的积累。贮藏28 d后臭氧处理组H2O2含量逐渐增加，可能是系统对H2O2的清除能力降低，使冬枣中H2O2产生速率大于H2O2清除速率。综上臭氧处理可以使果实内保持较低的H2O2含量，其中T1 组在贮藏后期效果更明显。

2.5 不同浓度臭氧处理对冬枣MDA 含量的影响

不同浓度臭氧处理对冬枣贮藏过程中MDA 含量的影响见图5。

图5 不同浓度臭氧处理对冬枣中MDA 含量的影响Fig.5 Effect of ozone treatment with different concentrations on the MDA content in winter jujubes

如图5 所示，T1、T2 处理组的MDA 含量随着贮藏时间延长呈现先下降后上升趋势，可能由于低浓度臭氧抑制了冬枣中MDA 的生成，但由于冬枣的呼吸代谢作用，果实中的MDA 含量又逐渐呈现升高趋势。CK组在14～84 d 的贮藏期内MDA 含量始终显著高于臭氧处理组（P＜0.05）。在贮藏28 d 时，T1、T2 和T3 组MDA 含量分别为CK 组的21.43%、33.04%、82.14%。由此说明适宜臭氧浓度处理抑制了MDA 的生成，有利于冬枣的贮藏，其中T1 处理组的效果较好。

2.6 不同浓度臭氧处理对冬枣VC 含量的影响

冬枣中含有丰富的营养物质，其富含的VC有很强的抗氧化能力，能与活性氧和臭氧发生作用，对果实起到保鲜作用[26]。不同浓度臭氧处理对冬枣VC含量的影响见图6。

图6 不同浓度臭氧处理对冬枣中VC 含量的影响Fig.6 Effect of ozone treatment with different concentrations on the VC content in winter jujubes

如图6 所示，冬枣中VC含量整体呈现先上升后下降的趋势，在贮藏14 d 时，CK、T1、T2 和T3 组的VC含量分别为419.03、403.89、403.69、383.85 mg/100 g。贮藏期间，CK 组VC含量整体较高，这可能是因为臭氧具有强氧化性和还原性，会与VC发生反应，从而降低果实中的VC含量。T3 组VC含量显著低于CK、T1、T2 组（P＜0.05），而T1 组VC含量较T2 组更为平缓。结果表明，虽然臭氧对VC含量有一定的消耗作用，但是适宜浓度的臭氧可以促进抗坏血酸-谷胱甘肽循环以抵御衰老[27]，其中T1 处理组对于维持冬枣VC含量有较好的效果。

2.7 不同浓度臭氧处理对冬枣APX 活性的影响

不同浓度臭氧处理对冬枣APX 活性的影响见图7。

图7 不同浓度臭氧处理对冬枣中APX 活性的影响Fig.7 Effect of ozone treatment with different concentrations on the activity of APX in winter jujubes

从图7 中可以看出，随着贮藏时间延长冬枣APX活性整体呈现先升高后降低的趋势，在14～42 d 内T2和T3 组APX 活性低于T1 组，这表明低浓度的臭氧可以维持较高的APX 活性。在56 d 时，各处理组的APX活性达到峰值，CK 组APX 活性为315.71U/g，T1、T2 和T3 组的APX 活性分别为356.25、337.00、370.51 U/g。在整个贮藏期内，臭氧处理组的APX 活性整体高于CK组，说明臭氧处理有助于提高冬枣的APX 活性，其中T1 组的效果较好。

2.8 不同浓度臭氧处理对于冬枣POD 活性的影响

过氧化物酶是活性氧清除系统中一种重要的酶，对于延缓植物细胞衰老，维持细胞膜活性有着重要作用[28]。不同浓度臭氧处理对于冬枣POD 活性的影响见图8。

图8 不同浓度臭氧处理对冬枣中POD 活性的影响Fig.8 Effect of ozone treatment with different concentrations on POD activity in winter jujubes

如图8 所示，POD 的活性呈现双高峰的变化趋势[29]，在0～14 d 内POD 活性的升高，意味着植物体内清除自由基的能力增强，在14 d 时达到第一个高峰，CK 组POD 活性为1.05 U/g，T1、T2 和T3 组POD 活性分别为1.71、1.63、1.48 U/g，且CK 组POD 活性与臭氧处理组之间有显著差异（P＜0.05）。在70 d 时POD 活性又到达高峰，CK 组POD 活性为1.36 U/g，T1、T2 和T3组POD 活性分别为1.83、1.73、1.66 U/g。这表明臭氧处理可以促进冬枣中POD 活性的提高，从而清除果实衰老过程中生成的H2O2，进而延缓果实的衰老过程，其中T1 处理组的效果较好。

3 结论

在冬枣采后贮藏期间，由于果实在自身呼吸蒸腾作用和低温胁迫影响下，导致冬枣果皮表面缩皱果品转红软化、腐烂变质等现象。本试验主要对比了不同浓度臭氧处理冬枣的品质，确定延缓冬枣采后生理品质下降的适宜臭氧浓度。

试验结果表明，臭氧处理，在贮藏期间能减缓冬枣果实硬度的下降、抑制冬枣的可溶性固形物含量变化，使冬枣仍具有较高的营养价值及食用品质；在贮藏期内，随着果实成熟，冬枣果实因呼吸作用消耗营养物质开始大量产生活性氧，造成植物细胞氧化损失。臭氧处理，激活了APX 和POD 的活性并抑制了·O2-产生速率，减少了贮藏期间产生的H2O2，提高冬枣自身的活性氧清除系统，减少因活性氧引发的细胞膜脂过氧化作用及MDA 的积累，有效避免采后冬枣衰老、软化、腐烂等品质劣变现象的发生。通过对整个贮藏期内冬枣品质变化的比较，发现T1 处理组更适宜用于采后冬枣的保鲜，能够使冬枣保持较高的生理品质和抗氧化能力。然而，臭氧具有较强的氧化性，对植物果实中的VC会有一定的破坏作用，因此在今后的研究中可以进一步探讨这些问题。