新疆野生大环柄菇的分子鉴定与遗传多样性分析

罗 影,努尔孜亚·亚力买买提,贾文捷,刘洁莹,贾培松

(1.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠绿洲作物有害生物综合治理重点实验室,乌鲁木齐 830091;2.新疆农业大学,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】大环柄菇属(Macrolepiota)隶属于担子菌门(Basidomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)、伞菌科(Agaricaceae)[1,2],约有45个种[3],多数为可食用真菌[4],其子实体一般大型,菌柄长,风味独特。葛再伟等[5]根据形态学与分子分子系统学证据,结合相关文献以及现有属下分类系统,建立了一个新组:具托大环柄菇组MacrolepiotasectionVolvatae,经鉴定我国的大环柄菇属真菌共有6种,即高大环柄菇(M.procera),裂皮大环柄菇(M.excoriata),脱皮大环柄菇(M.detersa),长柄脱皮大环柄菇(M.dolichaula),乳头状大环柄菇(M.mastoidea),和具托大环柄菇(M.velosa)。其中,M.detersa和M.excoriata为2个新种。明确大环柄菇分类地位及其野生资源的遗传多样性等问题,对于大环柄菇新品种选育、种质资源保护开发等具有重要意义。【前人研究进展】我国对大环柄菇属的研究始于20世纪80年代[6],多为真菌资源调查、分类与多样性研究,其在我国广泛分布于内蒙古[7-11]、黑龙江[12,13]、吉林[14]、江西[15]等地。另有少数对高大环柄菇(M.procera)的驯化栽培[16,17]与原生质体制备[18]等研究,及对脱皮大环柄菇(M.detersa)的鉴定[19]与化学成分分析和抗氧化活性评价等[20]。【本研究切入点】食用菌种内不同菌株在长期的进化过程中形成了丰富的遗传多样性,ISSR是以PCR技术核心,基于简单重复序列扩增多态SSR建立一种分子标记技术,是目前在分析和评估生物种群的遗传多样性中使用最广泛的分子标记之一[21],被广泛应用于食用菌菌株鉴定、遗传多样性分析及杂交育种等。直接从DNA水平上检测DNA多态性,不受环境条件和发育阶段的影响,扩增条带清晰、多态性强、重复性好,目前在阿魏菇[22,23]、香菇[24,25]、金顶侧耳[26]等菇种的遗传多样性分析。目前尚未有新疆大环柄菇的相关研究报道。需从分子水平研究鉴定新疆野生大环柄菇属菌株,分析其遗传多样性。【拟解决的关键问题】以新疆野生17株大环柄菇属菌株为试验材料,采用ITS分子标记对其进行生物学鉴定,用ISSR分子标记的方法,分析新疆不同地区的17株野生大环柄菇菌株遗传多样性,为新疆野生大环柄菇种质资源的开发和新品种的选育提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

17个野生环柄菇子实体均采集于新疆区域内,菌株保藏于新疆农业科学院植物保护研究所。

1.2 方 法

1.2.1 菌丝活化与菌丝体收集

将菌种接种到PDA平板上,25℃下避光培养15 d左右进行活化。活化后,取菌丝尖端再接于PDA平板,培养基表面铺一层玻璃纸。固体培养的菌丝体,用灭菌的接种刮沿着玻璃纸的表面将菌丝体轻轻刮下,置称量纸上,天平称量备用。

1.2.2 菌株生物学培养特征测定

将活化的17个大环柄菇供试菌株,打孔器分别打取活化后适龄菌种菌落边缘作接种块,接种至PDA培养基中央,每个菌株5个重复,25℃避光培养。定期观察菌株生长:菌丝颜色、菌丝浓密度等菌丝培养特征指标,菌丝生长速度采用“十”字交叉法测量菌落直径计算。

1.2.3 DNA提取

对收集的菌丝体进行干燥处理,取一部分干燥子实体,采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总DNA,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度。

1.2.4 ITS序列测定

采用通用引物 ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4:TCCTCCGCTTATTGGATATGC,(由生工生物工程股份有限公司合成)进行PCR扩增。PCR反应体系25 μL:引物(10 μmol/L)各1.0 μL、模板1.0 μL,2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL无菌双蒸水补足至25 μL。PCR扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,30个循环,72℃修复延伸10 min。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

将PCR产物交于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果提交至NCBI核酸数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/),进行BLAST比对分析。选取同源性较高的序列进行系统进化分析,利用MEGA 7.0软件进行多重序列比对,采用Neighbour-joining法构建系统发育树,进行1 000次Bootstrap自举法检验。

1.2.5 ISSR-PCR扩增与聚类

通过引物筛选试验[23,27]从42个引物中筛选出10个引物,扩增结果多态性较高,且扩增出丰富的多态性位点。筛选出的引物进行ISSR-PCR扩增,所用引物及扩增程序参考朱坚[27]方法,由上海生工生物有限公司合成。

扩增反应体系25 μL,其中 2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,引物(0.2 mmol/L)1 μL,模板1 μL,用ddH2O补齐至25 μL。扩增体系:94℃预变性 5 min;94℃变性 1 min,退火1 min,72℃延伸 1 min,35个循环;72℃补平 10 min。将扩增产物5 μL,点样于1.5%琼脂糖凝胶上电泳,检测ISSR扩增结果。表1

表1 供试ISSR引物的序列

将ISSR-PCR 的电泳结果进行人工比对校正,有条带记为1,无条带记为0,构建初始“0/1”矩阵表。统计条带总数及多态性条带数并计算多态位点百分率P,计算公式为:P=k/n(100%),式中:P为多态位点百分率,k为多态性位点数,n为测定的位点总数。

1.3 数据处理

使用NTSYSpc分析软件对所获数据进行聚类分析,生成遗传聚类图,根据聚类图分析供试野生大环柄菇菌株间的遗传多样性及遗传分化特征。

2 结果与分析

2.1 野生大环柄菇的子实体和菌丝体形态特征

研究表明,采集的野生大环柄菇子实体个体较小,菌盖白色,表面光滑,生长初期呈钟型,成熟后逐渐平展,呈伞状;菌褶白色,致密等长;菌柄中生,菌环位于菌柄上部。于PDA培养基上培养野生大环柄菇,菌落呈白色,菌丝浓密。各菌株菌丝体生长速度上差异明显,其中菌株HBG016菌丝生长最快,平均生长速度分别为2.17 mm/d;菌株HBG020菌丝生长最慢,平均生长速度为1.04 mm/d。图1,表2

图1 裂皮大环柄菇的菌丝和子实体形态

表2 大环柄菇菌株的菌丝培养特征描述

2.2 野生大环柄菇ITS分子鉴定

研究表明,大环柄菇的ITS序列大小介于720～750 bp,将测序结果在NCBI上进行BLAST,选取同源性较高的序列,以蘑菇属中国美味蘑菇(AgaricussinodeliciosusKM657908) 的ITS为外群,与供试的17个野生大环柄菇样本一起,用MEGA 7.0中Neighbor-joining 法(Maximum likehood Bootstrap trials=1000),构建系统发育树。采集的17株野生样本Blast结果均为裂皮大环柄菇,构建发育树也聚为一簇,鉴定采集的样本均为裂皮大环柄菇(Macrolepiotaexcoriata)。图2

图2 基于ITS序列的大环柄菇的系统发育树

2.3 野生大环柄菇菌株的ISSR多态性

研究表明,共选择44条ISSR引物,其中有10条引物对供试的17个大环柄菇菌株有很好的扩增效果,条带清晰,重复性好。10条引物共扩增出116条较为清晰的DNA条带,平均每个引物扩增出11.6条多态性条带。平均多态性条带频率为64.66%,供试菌株间的遗传多态性较高。图3,图4,表3

图3 ISSR-PCR电泳图谱(引物P4)

图4 ISSR-PCR电泳图谱(引物P22)

表3 ISSR 引物的扩增结果及多态性

2.4 供试菌株的聚类

研究表明,17个供试裂皮大环柄菇菌株间遗传相似系数范围在 0.71～0.99,其中HBG012和HBG013的相似系数达到了0.99,且二者菌丝形态相似,其遗传背景十分相似。在遗传相似系数0.75水平上17个供试菌株分为4个类群,第一类群为HBG001、HBG002、HBG005和HBG006,第二类群包括11个菌株,约占总数的64.7%;HBG008和HBG016与其他菌株区分开来,HBG008和HBG016与其他供试菌株之间的遗传差异较大。当遗传相似系数为0.85时,可分为8个类群,HBG005、HBG006、HBG009、HBG008和HBG016均单独为一类群,其中HBG008和HBG009采自新疆特克斯县,却分别在不同的类群,其余菌株均来自新疆哈巴河县,新疆野生高大环柄菇已经发生较为明显的遗传分化现象,具有比较丰富的遗产多样性。图5

图5 供试裂皮大环柄菇菌株ISSR多态性聚类

3 讨 论

3.1ISSR是1994年由由Zietkiewi CZ等创建的一种简单重复序列间扩增多态性分子标记[21],利用SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序,简便有效,被广泛应用于动植物种植资源鉴定、遗传作图、基因定位及分析和评估生物种群的遗传多样性等,而目前尚无裂皮大环柄菇(Macrolepiotaexcoriata)的相关报道。

3.2在ISSR分析中,裂皮大环柄菇的样本仅有17个,且大多为哈巴河县采集获得,但是10条ISSR引物还是扩增出了116条清晰的DNA条带,多态性条带75条,多态比率为64.66%。聚类分析结果也显示,在遗传相似系数0.75水平上17个供试菌株分为4个类群,在遗传相似系数0.85水平上,可分为8个类群,HBG005、HBG006、HBG009、HBG008和HBG016均单独为一类群,新疆野生高大环柄菇已经发生较为明显的遗传分化现象,具有比较丰富的遗产多样性。

4 结 论

采集于我国新疆境内的17个大环柄菇属样本经ITS序列测定从分子水平上鉴定均为裂皮大环柄菇(Macrolepiotaexcoriata)。对其生物学菌丝培养特征包括菌丝长速、长势、菌落形态进行了描述;10条ISSR引物共扩增出116条清晰的DNA条带,多态性条带75条,多态比率为64.66%。各菌株间遗传相似系数范围在 0.71～0.99,遗传相似系数为0.85时,可将17个样本分为8个类群。新疆分布的裂皮大环柄菇已开始发生遗传分化,具有丰富的遗传多样性。