唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭微环境的研究进展

韩楚 李锦锦 候娜 李龙江

唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是一种比较常见的头颈部恶性肿瘤,其发生率在唾液腺来源恶性肿瘤中为7.5%～10%[1,2]。肿瘤的原发部位常见于各部位的唾液腺,尽管多数发生于小唾液腺如舌下腺和腭腺等,但在大唾液腺中,如颌下腺和腮腺也有不同程度的累及[3]。SACC的特点是浸润性强,易沿神经扩散以及血行转移率高。早期肿瘤多数生长缓慢,但是中晚期SACC患者可能会出现疼痛甚至神经损伤的症状,这与肿瘤的嗜神经侵袭(perineural invasion,PNI)特性密切相关。嗜神经侵袭是指肿瘤沿着神经纤维扩散生长的现象,包括浸润神经纤维周围和侵入神经纤维内,被广泛认为是肿瘤转移的第四种途径。前三种肿瘤转移途径分别为肿瘤直接侵犯周围组织、血行转移和淋巴系统转移。PNI这一病理特性与肿瘤的远处转移及不良预后密切相关[4]。目前,关于肿瘤神经侵袭研究的主要理论为“肿瘤与神经相互作用”的微环境理论[5]。因此,深入研究唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭的微环境对于提高该疾病的预后至关重要。本文主要从唾液腺腺样囊性癌的特点,PNI的定义,肿瘤嗜神经侵袭微环境及相关分子机制方面做一综述。

1 唾液腺腺样囊性癌的特点

SACC可原发于唾液腺的不同解剖部位。大多数SACC来自小唾液腺(约占75.4%)。在大唾液腺中,53.3%的肿瘤累及颌下腺,46.7%的肿瘤累及腮腺[3]。与其他的上皮源性恶性肿瘤相比,SACC患者的5年生存率相对较高,然而SACC的复发率也很高,这与PNI的发生密切相关[6]。

研究发现,SACC累及淋巴组织的情况并不常见,即使SACC发生远处转移后在临床上很长时间可以没有任何症状,因此,多数患者就诊时已处于该疾病的中晚期[4]。而且即使原发部位手术完全切除且未发现复发的情况下,经过一段时间后SACC仍然高概率地会扩散到身体的其他部位,这也是SACC患者死亡的主要原因。也有研究显示,SACC的预后与肿瘤的边缘侵犯显著相关,Amit等分析了507例SACC患者的资料,结果显示阳性边缘的患者预后最差,阴性边缘和近缘预后相对较好,而且SACC患者预后与肿瘤转移的距离无关[7]。因此对于SACC而言,无论是局部的侵犯还是发生远处转移,外周神经侵袭都在其中发挥了不可忽视的作用,且与预后显著相关。

2 PNI的定义和特点

在1985年,PNI的概念由Batsakis首次提出:肿瘤细胞侵袭、包绕或穿过神经,这也是比较常用的PNI的定义[8]。而外周神经在组织学上主要由三层结缔组织构成:(1)神经内膜,主要是神经的轴突;(2)神经束膜;(3)神经外膜。因此,在2009年,Liebig提出肿瘤细胞出现在3层神经纤维中任何一层均可以视为发生了PNI,并且把PNI的定义拓展为两种神经被侵袭的组织学模式:第一种是肿瘤细胞位于神经的周围并至少累及神经周长的1/3左右,第二种是肿瘤细胞侵入到神经内的任何一层结缔组织[9]。虽然这一新的定义涵盖了大多数微观方面,包括神经周围和神经内侵袭,但对接近神经周长1/3的定义可能是经验主义的描述。因此,目前关于PNI的定义仍需完善,为PNI制定一个客观的、被广泛接受的定义尚具有挑战性。

研究表明PNI与肿瘤远处转移和患者不良预后显著相关[10]。Luksic等[11]研究发现,在一组手术切缘清晰的肿瘤患者中,80%的PNI患者最终发展为局部或远处复发,而在非PNI患者中只有27%出现复发。在另一项研究中,研究者发现伴有PNI的SACC极易发生远处转移,而没有PNI的SACC则没有发生远处转移,多因素分析显示PNI是肿瘤远处转移的重要预测因素[12]。这些结果均表明PNI增强了肿瘤发生远处转移的概率,从而影响患者的预后。

3 PNI相关微环境

关于PNI的发生,最初的研究理论认为是由于外周神经区域解剖通道的低阻力抗性。然而,随着分子生物学以及精准医学的快速发展,我们逐渐认识到PNI的发生并非单一因素作用的结果。神经系统与肿瘤细胞的相互作用为肿瘤细胞在神经周围生长和增殖提供了合适的微环境[5]。目前研究者普遍认为神经侵袭的发生涉及多种微环境调节因子,包括趋化因子及其受体、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF) 家族蛋白及其受体、神经生长因子 (nerve growth factor,NGF) 家族蛋白及其受体,以及基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)等[13]。肿瘤与神经周围的细胞包括雪旺细胞、成纤维细胞和细胞外基质、炎性介质以及各种可溶性的信号分子及受体形成了一个复杂的微环境,使得肿瘤和神经可以直接或间接通过信号转导通路的打开和关闭或者配体和受体的识别和反应实现相互作用,从而导致了PNI。

3.1 SACC发生PNI的解剖学因素 PNI是胰腺癌、胃癌、前列腺癌、头颈部癌等多种肿瘤的常见临床表现[14-17]。PNI不同于沿神经侵犯(perineural spread,PNS)。具体来说,在微观水平上,PNI的特征是肿瘤组织局限地侵入神经,而PNS指的是通过神经周围空间或神经鞘和神经组织本身的肿瘤远端分布的一种影像表现[18]。2009年,Liebig等[9]提出,肿瘤细胞的PNI可以被定义为肿瘤细胞位于神经纤维周围,围绕它们至少33%的范围或肿瘤细胞浸润到神经组织的任何一层,如神经内膜,神经束膜,和神经外膜。也有一些学者根据肿瘤侵犯神经组织的范围,神经侵袭分为神经外侵犯,神经周围侵袭和神经内侵袭。其中,神经内侵犯是肿瘤预后不良的独立预测因子[19]。

正常的周围神经由三层不同特征的结缔组织组成。神经外膜是最外层的筋膜层,由致密不规则的结缔组织组成,将单个神经束捆绑成神经干;神经内膜是神经组织最内层,与雪旺细胞(Schwann cells) 一起围绕着轴突;神经束膜,即中间层,是由一层层扁平的细胞构成的层状结构包裹着单个神经束。神经外膜包围着整个神经干,因此有助于神经的抗拉强度,但它不提供屏障功能。神经束膜和神经内膜的血管系统形成紧密连接结构,构成了周围神经屏障。这些结构被认为是某些分子和离子在细胞旁扩散的屏障[20]。因此,我们推测恶性肿瘤的PNI是指当肿瘤细胞开始侵入外周神经时,通过扰乱和拆除神经周围的紧密连接结构,形成的神经渗透现象。

3.2 雪旺细胞 雪旺细胞又被称为神经胶质细胞,在神经损伤的修复以及轴突的再生中发挥重要功能。以往的研究显示雪旺细胞在受侵犯的神经周围普遍存在的,甚至在神经侵袭发生之前,就可以在肿瘤的周围检测到雪旺细胞的存在[13]。这表明雪旺细胞在神经侵袭的发生和发展中发挥了一定的作用。肿瘤发生神经侵袭时,神经细胞会受到一定程度的损伤,而雪旺细胞可以调控神经的生长和修复。因此,部分研究者认为发生了PNI的神经细胞会出现一定的“去分化”现象,通过活化为增殖和修复能力更强的雪旺细胞,辅助神经的修复和再生,同时通过可溶性信号分子的直接接触和分泌,使得基质成分重构,促进新生神经的靶向性,反向加剧PNI[21]。通过唾液腺腺样囊性癌细胞和雪旺细胞的体外共培养,Shan等[22]研究发现雪旺细胞可以通过BDNF和原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B,TrkB)间的相互作用使唾液腺腺样囊性癌细胞发生上皮间充质转化,从而增强其神经侵袭的能力。

3.3 成纤维细胞和神经纤维 成纤维细胞是神经束膜的主要组成部分,肿瘤微环境中成纤维细胞的改变可以影响神经束膜的渗透性以及对外界刺激的抵抗性,这与PNI的发生密切相关[23]。除此之外,癌相关成纤维细胞也存在于肿瘤微环境中,可通过促进肿瘤生长、血管形成、炎症发展和转移发生,促进肿瘤的进一步恶化。Xu 等[24]发现唾液腺腺样囊性癌的外泌体可以被牙周膜成纤维细胞内吞,从而促进炎性细胞因子和神经生长因子(neural growth factor,NGF)的分泌以及神经营养受体酪氨酸激酶1(neurotrophic receptor tyrosine kinase1,NRTK1)的表达,增强癌细胞的迁移和侵袭。Zhang 等[25]发现胃癌中癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)的密度与肿瘤的TNM分期和神经侵袭能力呈正相关。

轴突,也被称为神经纤维,是线状的突起,在皮肤、肌肉、关节和内部器官的神经和受体之间传递电信号[26]。越来越多的证据表明,肿瘤的侵袭依赖于轴突结构,去神经支配可以抑制肿瘤的生长和转移[27]。最近两篇综述揭示了神经纤维在癌症中的重要作用,并描述了神经系统的双向干扰,神经能控制癌症的发生、生长及转移,而癌症会导致神经系统的功能改变[28,29]。近年来,癌症外泌体被发现可以诱导肿瘤的神经支配,Couto等[30]研究发现头颈肿瘤患者的外泌体可以诱导周围神经突的生长,而健康对照组的外泌体则没有该作用。然而,由于肿瘤微环境的复杂性,神经纤维在肿瘤微环境中的作用及机制至今仍是一个有待进一步研究的领域。

3.4 NGF家族和受体 NGF家族是神经细胞生长和存活所必须的一类蛋白分子,主要包括NGF,神经营养因子-3(neurotrophin 3,NTF-3),神经营养因子-4(neurotrophin 4,NTF-4),BDNF以及神经胶质细胞源性的神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)[31]。除了GDNF,这些成熟的神经营养因子中每一种都与它们特定的酪氨酸受体激酶(tropomyosin-receptor kinases,TRK)受体以高亲和力结合,p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)以低亲和力结合来发挥功能。例如NGF和TRKA结合,BDNF和NTF-4与TRKB结合,NTF-3与TRKC结合。而GDNF及其配体artemin,neurturi 和persephin均属于转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,分别与GDFRa1-a4结合发挥作用。通过与不同受体结合,NGF可以触发多种信号通路,这些通路在细胞生长、凋亡和神经元形成的调控中发挥作用。此外,它不仅对外周神经系统和中枢神经系统的神经细胞的生存、生长和分化具有许多重要的调节功能,而且在交感神经细胞和感觉神经细胞中发挥调节神经递质和神经肽的合成的作用[31]。因此NGF不仅调控了神经的生长和分化,在神经细胞的传递和转导中也发挥了重要作用。

目前,多项研究证实NGF的高表达与肿瘤PNI的发生以及患者不良预后显著相关[32]。在胰腺癌研究中,研究人员发现与邻近的正常组织相比,胰腺癌中NGF的表达水平升高,周围神经中TRKA的表达水平也出现显著的上调,NGF和TRKA的表达情况与神经侵犯的发生率和不良预后之间存在显著的正相关。BDNF被认为是“脑肥料”,因为它可能在促进现有神经元的生存以及诱导新神经元和突触的增殖和分化方面发挥作用[33]。Jia等[34]发现BDNF和TRKB表达水平的升高与SACC的临床晚期、预后不良、PNI、血管浸润和远处转移均显著相关。Zhang等[35]的研究提出了PNI与MIF表达之间的相关性,认为MIF可能通过促进SACC的EMT分化进而参与细胞骨架重组和伪足形成,促进SACC的PNI。有研究报道在SACC标本中TRKB和E-cadherin表达之间存在显著的负相关,该证据支持了BDNF/TRKB轴在SACC的 PNI发展过程中EMT的潜在作用[22]。

证据表明PI3K/Akt信号通路与ACC的PNI发生相关。研究发现NGF 主要与TRKA高亲和力结合,通过激活PI3K/Akt和Ras/MAPK信号通路,促进肿瘤的增殖和侵袭,从而促进PNI的发生[32]。 此外,动物实验也表明AKT3的高表达是唾液腺恶性肿瘤进展的驱动因子[36]。Li等[37]发现,SCs和SACC细胞共培养后,NT-3和TRKC的表达在基因和蛋白水平上均显著上调。人体样本的免疫组化染色也显示NT-3和TrkC的阳性表达与SACC的PNI发生显著相关。因此,通过阻断NT-3/TrkC轴干扰SACC细胞与SCs之间的相互作用可能是减少PNI发生的有效策略之一。

3.5 GNDF家族和受体 GDNF家族蛋白来源于神经胶质细胞系,是一组神经营养多肽,由四个成员组成:神经秩蛋白 (NRTN)、persephin (PSPN)、artemin (ARTN)和胶质细胞源性神经营养因子 (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor,GDNF)。GDNF最初从大鼠胶质瘤细胞系的上清液中分离出来,被证实对中脑多巴胺能神经元的存活有显著的影响。它主要以旁分泌的方式产生,在中枢和外周神经系统的发育和维持、肾脏形态发生和精子形成中发挥重要作用[38]。GDNF、NRTN、ARTN和PSPN分别与GFRA1 (GDNF家族受体alpha-1)、GFRA2 (GDNF家族受体alpha-2)、GFRA3 (GDNF家族受体alpha-3)和GFRA4 (GDNF家族受体alpha-4)结合。He等[39]采用DRG模型,发现DRG可通过释放可溶性GFRA1,增强原癌基因RET(ret proto-oncogene,RET)的磷酸化作用和SACC细胞的迁移,而PNI的发生可能是由于神经组织分泌GDNF,进而激活肿瘤细胞中RET的原因。GFRA1作为RET的共同受体,两者都是GDNF发挥作用所必需的。

3.6 细胞粘附分子 神经细胞黏附分子(neural cell adhesion molecule NCAM)是一种跨膜蛋白,在细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的黏附发挥着重要作用。在最近的综述中描述了NCAM与PNI之前的联系,Li 等[40]在前列腺癌样本的免疫染色结果显示,发生了PNI的组织样本中NCAM的阳性率显著高于未发生PNI组。Deborde等[41]采用转基因小鼠技术,发现NCAM缺陷小鼠的PNI发生率显著低于正常小鼠。这些都提示NCAM可能参与了PNI的过程。

ICAM-5是一种细胞间黏附分子,有研究通过分析30种不同的人类癌症细胞系和25种头颈部鳞癌的标本中ICAM-5 mRNA的表达和功能状态,证明了ICAM-5的表达与PNI的发生密切相关[42]。此外,在人胰腺导管癌中,雪旺细胞分泌的L1CAM可以通过激活STAT3途径并上调MMP2和MMP9的表达来增强癌细胞的神经趋化能力,进而诱发PNI[43]。

3.7 趋化因子和受体 趋化因子和它们相应的受体在肿瘤的侵袭中起重要作用。趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12,CXCL12)/趋化因子受体(C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)在SACC中可以通过Twist/S100A4 轴诱导癌细胞的EMT转化,促进PNI的发生[44]。在胰腺癌中,CXCR4的刺激导致MMP9的分泌,并可能通过增强细胞外基质(ECM)降解进而参与PNI的过程[45]。趋化因子配体1(C-X3-C motif chemokine ligand 1,CX3CL1)/趋化因子受体(C-X3-C motif chemokine receptor1,CX3CR1)在早期胰腺癌和前列腺癌中高表达,其中CX3CR1可以通过β1螯合素诱导细胞粘附分子的表达,进而促进肿瘤细胞的神经迁移[46]。同样地,无论体内模型还是体外实验,表达CCL2的神经细胞均可诱导表达CCR2的癌细胞向神经细胞方向迁移,进一步加速PNI的发展[47]。

3.8 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族是一种内肽酶家族,其主要作用是降解细胞外基质和进行组织重塑。在神经的解剖结构中,各类型的胶原纤维均是构成神经鞘基底膜的主要成份。有的胶原蛋白已被证实在周围神经中表达,如Ⅳ型胶原蛋白,是SCs基底膜的主要成份[48]。由于肿瘤细胞在不分泌蛋白酶的情况下是无法穿过细胞外基质以及神经鞘的,因此MMPs很可能在PNI的发生中发挥重要作用。MMP2、MMP7、MMP9和Ⅳ型胶原酶在NGF或GDNF的调控下分泌,所以MMPs可能是PNI发生的前提[49]。此外,L1-CAM也可以刺激MMP-2的表达,正向调控PNI的发生[43]。

3.9 其他相关分子 胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2,IGFB2)是一种多肽物质,有促生长的作用。Yao 等[50]发现IGFB2 以NF-κB (p65)依赖的方式增强了SACC中ZEB1的表达,进而促进了SACC中上皮-间质转化。而核定位信号中IGFBP2的突变可以阻碍p65的核易位,降低ZEB1的表达,并消除EMT过程。

甘丙肽(Galanin,GAL)是神经细胞在损伤和炎症状态下分泌的一类神经肽。常规有3个受体:GAL-R1,GAL-R2和GAL-R3。它可以与相应受体结合,在钙调神经磷酸酶脱磷酸化的诱导下,通过激活活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)促进肿瘤细胞中环氧化酶-2 (COX-2)和甘丙肽的表达,进而调控肿瘤PNI的发生[51]。

Slug是锌指转录因子家族的重要成员。近年来,Slug和细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)均被证实对基质金属蛋白酶的分泌有正向促进作用。通过调控癌细胞的上皮间充质转化促进PNI的发生[52]。

除了上述分子,基因p53以及因子MIF、CTSD和NPY等在肿瘤的PNI中均有涉及[35,53]。 这些研究证明了PNI的发生是一个多因素共同作用的结果。

这些结果均表明,神经确实能够为肿瘤的生长提供适宜的环境,并且这种相互作用对神经和肿瘤的生长都有积极的影响。

4 PNI的可能机制

由于唾液腺腺样囊性癌发病缓慢,嗜神经侵袭性强且远处转移率高等特点,SACC是目前研究比较广泛的肿瘤。其中,PNI与患者的预后关系密切,是当前研究的热点。关于PNI,近年来研究者们已从“肿瘤主动侵袭神经”的研究模式转变为“神经主动吸引肿瘤”,以及“肿瘤和神经之间相互作用”的模式。基于当前的研究,肿瘤及神经周围微环境中的细胞,各种因子和酶等在调控PNI的发生中起了重要作用。然而,随着研究的不断深入,其他因素如外泌体、各种microRNA和lncRNA等在肿瘤微环境中的功能也在不断地被探索。

外泌体是细胞分泌的直径为40～200 nm左右的微泡,包含 mRNA、miRNA、 lncRNA、蛋白质和 DNA 等几乎所有细胞遗传所需的生物活性物质。通过一系列的“外排”“融合”“内吞”等模式在细胞间产生生物学效应[54]。以往的许多研究表明,不仅肿瘤细胞比正常细胞产生更多的外泌体,而且肿瘤源性外泌体(tumor-derived exosomes,TDE) 包含多种蛋白质、mRNA、miRNA和脂质,可以调控间质细胞、内皮细胞、炎症细胞和免疫细胞,以调节肿瘤微环境,促进肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成。Xu等[24]发现肿瘤来源的外泌体可以作用于微环境中的成纤维细胞,通过介导NGF/TRKA的分泌促进SACC的转移。

此外,肿瘤细胞不仅可以改变周围的细胞和远处的微环境,肿瘤中其他细胞/肿瘤转移前的微环境也可以通过外泌体作用于肿瘤细胞,使得肿瘤细胞及其微环境在肿瘤的扩散和转移中互相协同。最近的一项研究表明,星形胶质细胞释放的外泌体可以诱导PTEN靶向的microRNAs转移到肿瘤细胞中[55]。这一发现表明,来自非肿瘤细胞的外泌体也可能促进弥散性的肿瘤细胞对靶器官的适应,表明在肿瘤发生转移前微环境的存在。最近发表的一项研究报告称,肿瘤源性外泌体可诱导肿瘤神经支配,主要通过外泌体包装的轴突引导分子EphrinB1来增强该作用[56]。这表明针对外泌体发生和释放的干预可能对PNI有治疗价值。特别值得注意的是,有研究发现来自腺样囊性癌细胞系 SACC-83的外泌体可以被人脐静脉内皮细胞 (HUVECs) 摄取,通过破坏血管内皮屏障实现远处转移[57]。考虑到原发肿瘤源性的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)可以破坏上皮细胞紧密连接组装,诱导EMT,并破坏血管通透性,使癌细胞扩散。我们认为EVs也可能有助于神经周围屏障的破坏,正向调控神经侵袭前微环境的形成。此外,尽管一些研究人员已经描述了肿瘤和间质源性的EVs在肿瘤转移级联反应中不同阶段的作用,但关于SACC和PNI中细胞外囊泡调控肿瘤细胞侵袭和转移的研究却很少。而癌相关成纤维细胞外泌体被证明也可以通过调控肿瘤微环境增加胰腺癌的化学抵抗[58]。Fang 等[59]发现肿瘤来源外泌体中的miR-1247-3p可以活化癌相关成纤维细胞从而促进肺癌的肝转移。

甘丙肽是一种典型的神经肽,它可以在多种生理过程中发挥作用,如进食、痛觉、血压调节等。但是关于其对肿瘤的作用,不同的研究之间存在显著差异[60]。 此外,层粘连蛋白-5(Laminin-5)和胰岛素样生长因子-Ⅱ mRNA结合蛋白-3 (insult like growth factor-Ⅱ mRNA binding protein 3,IMP3) 在各种恶性肿瘤中是评判预后的指标。有研究显示它们在伴有PNI的OSCC患者的术前活检标本中也有阳性表达[61]。尽管如此,它们是否可以作为SACC的PNI分子标志物仍需进一步研究。

PNI是肿瘤与神经之间多种因素相互作用的结果,这些作用一定程度上促进了肿瘤的生长和迁移。未来仍需对SACC神经侵袭的分子机制进行更加全面地研究,同时要结合临床改善患者预后,进而实现基础研究向临床转化才是研究的根本意义所在。