元宝枫种子生活力TTC 法检测技术研究

马 鑫，张俊杰，孙延国，鲁仪增，李 猛，宋福荣，赵云朝，许庆标，刘金锦，张连合，仝伯强，穆艳娟*

（1.兴林（北京）林业工程设计研究院有限公司，北京 100091；2.山东农业工程学院，山东 济南 250100；3.国家林业和草原局元宝枫工程技术研究中心暖温带林草种质资源保存与利用国家林业和草原局重点实验室 山东省林草种质资源中心，山东济南 250102；4.菏泽市林业局，山东 菏泽 274000；5.成武县国有林场，山东 成武 274200）

元宝枫（Acer truncatum Bunge）又名元宝槭、平基槭等，为我国无患子科（Sapindaceae）槭属（Acer Linn.）植物，其分布范围广、栽培历史悠久，是我国特有的观赏树种、木本油料树种[1,2]。元宝枫叶中含有多种与人体健康有关的活性成分，元宝枫的果皮、果翅和种皮含有大量的优质缩合性单宁，而单宁具有抗氧化、抗血栓、降低胆固醇等功效，有益于心脏血管疾病的预防。而且元宝枫油是植物源神经酸的重要来源，进一步促进了元宝枫药用价值的开发利用。尤其近10 多年来，元宝枫产业基础研究与培育技术开发纵深发展，并且在槭属植物源神经酸开发[3]、元宝枫籽油列入新资源食品[4]以及元宝枫叶、树皮、枝条等利用研究[5-8]等方面取得了突破，陆续测序组装了元宝枫的叶绿体基因组[9-11]、全基因组[12]并挖掘了神经酸的生物合成调控基因等，报道了元宝枫嫁接育苗技术[13,14]、扦插育苗技术[15-18]、组培快繁技术[19-23]等无性繁育技术和结实规律[24]，元宝枫的全株开发利用前景越来越广阔[25,26]。最新研究还发现神经酸可以通过发芽刺激富集在元宝枫的种子中[27]。但是，元宝枫种子生物学研究薄弱[28]，元宝枫种子萌发率不高（66%）[29]，元宝枫的机理研究[30]及繁育研究[31]均基于发芽法，易造成不可控的经济损失。《GB2772-1999 林木种子检验规程》[32]也只采用发芽法进行元宝枫种子生活力测定，常规检测法下的元宝枫发芽率低而且检测周期长，远远满足不了现代育苗、生产对元宝枫种子生活力快速检测的需求。2,3,5-氯化三苯基四氮唑法（TTC 法）是国际上检测木本油料树种种子生活力的通用快速、高效方法[36]。本研究以元宝枫家系种子为材料，探索建立元宝枫种子生活力TTC 快速检测方法，以期为元宝枫产业发展提供一定支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以国家林业草原元宝枫工程技术研究中心于2020 年秋季采集的元宝枫种子为材料，采种后室温自然晾干，去除果皮后备用。其中，正交试验中每处理的种子数量为10 个；最佳染色温度筛选所用种子为2 个河北省种源的元宝枫单株种子（单株编号HB060 和HB067）和1 个山东省种源的单株种子（单株编号SD001），正交试验中每处理的种子数量为20 个。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理方法

将元宝枫种子置于20～25℃的水中浸泡18h，随后放置3～5℃的环境中预处理10～14 d。按照向振勇等提供的方法[33]配置TTC 浓度梯度为0.5%、0.75%、1%，置4℃冰箱备用。染色处理温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。

1.2.2 染色方法

按照正交设计进行染色试验。将处理完毕的元宝枫种子置于暗盒内进行TTC 染色，每盒10 粒，参照《GB2772-1999 林木种子检验规程》[32]茶条槭（A.ginnala Maxim.）TTC 处理时间，分别将含有元宝枫种子的暗盒放置于培养箱中避光加热48h。随后，按照向振勇等提供的方法[33]从元宝枫种子中取出胚，检测元宝枫胚的染色程度判断元宝枫种子的生活力，计算具种子生活力（Seed viability，SV）的百分比：SV=（有生活力的种子数量/供试种子总数）×100%。具最佳染色效果（The best dyeing effect，BDE）的所占百分比，BDE=（具最佳染色的种子数量/供试种子总数）×100%。

1.2.3 数据处理方法

利用Microsoft Office Excel 2013 和SPSS 18.0 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 元宝枫种子生活力对不同处理的响应

TTC 浓度和不同处理染色温度，对元宝枫种子的染色效果均有一定影响（表1），其中SV 为50%～95%，平均为76.17%；BDE 为22.5%～75%，平均为53.33%。由表1 进一步分析表明，随着TTC 浓度由0.5%升高至1%，SV 和BDE 均逐渐增高，分别为71%和50.5%、74.5%和51.5%、83%和58%；随着染色处理温度由20℃升高至40℃，SV 和BDE 的变化也基本一致，呈现先增高后降低的趋势，分别为59.17%和32.5%、75.83%和41.67%、79.17%和64.17%、84.17 和59.17、82.5%和69.17%，TTC 的浓度越高元宝枫种子中具活力种子的检出比例越高，而染色温度以35℃～40℃为宜。

表1 不同处理下元宝枫种子染色情况

SV 与BDE 呈极显著正相关（相关系数为0.817），具生活力的元宝枫种子所占比例越高，相关处理的染色率越高，具最佳染色效果元宝枫种子所占的比例也越高。

元宝枫SV 最低的组合为处理1（表1），TTC 浓度为0.5%，染色温度20℃；元宝枫SV 最高的组合为处理14（表1），TTC 浓度为1%，染色温度35℃。

2.2 正交试验结果的极差分析

TTC 浓度和染色温度对元宝枫种子生活力影响的极差分析（表2）表明，染色温度的极差R2 （25） 大于TTC 浓度的极差R1（12），表明染色温度对元宝枫SV 的影响大于TTC 浓度对其SV 的影响。TTC 浓度中，K3 最大，浓度为1%；染色温度中，K4 最大，染色温度为35℃。极差分析表明，元宝枫种子TTC 检测的最佳条件为TTC 浓度为1%；染色温度为35℃。

表2 不同处理对元宝枫种子生活力影响的极差分析

2.3 不同处理的主效应检验

TTC 浓度和染色温度处理的交互效应检验结果（表3）表明，TTC 浓度及其与染色温度互作对SV 的影响均较小，均未达到显著水平； 温度0.05 水平上对SV 的影响较大，达到显著差异水平。说明与极差分析结果一致，染色温度对SV 的影响较大，需要进一步筛选出最佳处理温度。

表3 元宝枫种子不同处理的主效应检验

2.4 元宝枫种子生活力TTC 法最佳检测处理因子验证与筛选

2.4.1 TTC 最佳浓度验证与筛选

不同单株元宝枫种子的生活力检测结果（表4）进一步表明，不同TTC 浓度梯度下，检测出具有活力的种子数量为16.89～17.78 个，平均为17.22 个，变异系数为2.3%；SV 为84.44%～88.89%，平均为86.11%，变异系数为2.3%。BDE 为72.22%～73.33%，平均为72.78%，变异系数为0.62%。以上说明，在TTC 浓度0.5%～1%变化时，TTC 法用于元宝枫种子生活力检测时的检出能力均较强，不同单株之间的变化不大。从具有生活力的元宝枫种子检出数量、SV 以及BDE 来看，均以TTC 浓度1%时最为理想。综合选择以1%TTC浓度最佳。

表4 不同家系元宝枫种子生活力对TTC 浓度处理的响应

2.4.2 TTC 最佳染色温度验证与筛选

不同家系元宝枫种子生活力检测结果（表5）进一步表明，不同染色温度梯度下，检测出具有活力的种子数量范围为17～17.67个，平均为17.22 个，变异系数为1.82%；SV为85%～88.33%，平均为86.11%，变异系数为1.82%。BDE 为68.89%～76.67%，平均为72.78%，变异系数为4.36%。以上说明，在染色温度35℃～40℃梯度下，TTC 法用于元宝枫种子生活力检测时的检出能力也均较强，不同单株之间的SV 变化相对较小，BDE 的变化相对较大。从具有生活力的元宝枫种子检出数量、SV 以及BDE 来看，综合以37.5℃染色温度下，SV（91.67%）和BDE（81.67%）的结果均最佳。

表5 不同家系元宝枫种子生活力对不同温度处理的响应

3 结论与讨论

3.1 结论

染色温度显著影响元宝枫种子的染色效果，随温度升高染色效果先逐渐增强再稍微减弱；染色效果随TTC 浓度升高而逐渐增强，但TTC 浓度及其与染色温度的交互作用对元宝枫种子染色效果的影响均未达到显著水平。TTC 浓度0.5%～1%，染色温度为35℃～40℃时，TTC 法在不同单株之间的检验能力基本相当，适用于元宝枫种子生活力检测。其中，以TTC 浓度为1%、37.5℃染色处理条件下开展元宝枫种子生活力检测最为理想。

3.2 讨论

TTC 法在植物种子检验中具有简便、快捷、有效、准确等优点[33,34]。其中，TTC 浓度决定了染色效果的深浅，而温度影响到染色效果的呈现速度，二者综合决定了TTC 法检测的效果和灵敏程度。但是近年来，一直没有建立起元宝枫种子生活力快速检测方法体系，传统方法耗时长、效果差，不利于元宝枫种子调拨及育种评估。本研究通过对元宝枫种子生活力检验的TTC 浓度和温度梯度处理，进行正交分析及其在不同单株间进行重复验证筛选，从中得出的最佳TTC 浓度和最佳温度，研建了元宝枫种子TTC 快速检验方法，为元宝枫相关科研生产提供了技术支撑。