超高效液相色谱——串联质谱法同时测定农田环境中16 种磺胺类抗生素

张 彤,孟祥勇,杨智宇,徐宜宏,付海滨,栗 杰,粟有志,张 敏,于 丽

(1.沈阳海关技术中心,辽宁 沈阳 110016; 2.辽阳海关综合技术服务中心,辽宁 辽阳 111000; 3.沈阳农业大学,辽宁 沈阳 110866 ; 4.伊宁海关技术中心,新疆 伊宁 835000)

磺胺作为一类广谱抗菌药物,主要用于临床上传染病的防治。 被畜牧业和兽医诊所广泛用于饲料添加剂和动物疾病的治疗[1～4],由于兽用抗生素并不能完全被动物体所吸收,约30% ～90%抗生素随着畜禽粪便排泄出来[5～6],而畜禽粪便通常会作为肥料回到农田中,从而也对农田环境(水、土壤)造成了污染[7～12]。

据调查显示,目前国家标准中检测磺胺类药物的方法有SC/T 9436-2020,可以同时检测21 种磺胺类药物,在水产养殖环境中养殖水中检出限为1～5 ng/ml,养殖环境底泥中检出限为12.50 ～50 ng/g。 GB 31658.17-2021 可以同时检测19 种磺胺类药物,且动物组织检出限为2.0 μg/kg;GB/T 22966-2008 使用范围窄仅适用于牛奶和奶粉,可以检测16 种喹诺酮类物,检出低限1.0 μg/kg;GB/T 22947-2008,可以同时检测18 种磺胺类药物但是基质只适用于蜂王浆,检测低限5.0 μg/kg。 所以综上所述,现有的国家标准中并没有应用于农田环境中16 种磺胺类药物的检测方法。 而且现有的相关文献中对于磺胺类药物残留的检测也多为食品,仅有的水和土壤中的检测方法也因为磺胺种类少而应用较少[13～18]。 为此,本研究针对农田环境中磺胺咧类抗生素检测方法存在不足的现状,运用UPLC-MS S 技术,建立了农田环境中16 种磺胺类抗生素残留的快速筛查方法,为处理农田环境中的磺胺类化合物,以及后期农田环境的使用安全提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器:UPLC-MS 8060,日本岛津公司)、固相萃取仪(美国Supelco 公司)超纯水机(乐枫公司)、电子天平、氮吹仪、离心机、均质器。

试剂:16 种磺胺类化学标准品(购自德国Dr.Ehrenstorfer,纯度≥96%),乙腈、甲醇、甲酸为色谱级、PSA、500 mg/6ml MCX 固相萃取柱(均购自美国迪马公司)。

1.2 样品提取与净化

1.2.1 试样制备

土壤:按照《YC/T 386-2011 土壤中有机氯农药残留量的测定 气相色谱法》方法制备。

水样:每个采集到的水样至少为1 L,密闭容器中保存待用,测定前摇匀。

1.2.2 提取

土壤:称取10.0 g 混合均匀试样,于100 ml 离心管中,加入50 ml 乙腈,4 000 r/min 超声提取30 min,过滤提取液,重复提取1 次,合并滤液,加入5.0 g 无水硫酸钠,涡混1 min、4 000 r/min 离心5 min,取上清液,待净化。

养殖废水:称取250 ml 水样于500 ml 分液漏斗中,加入2 g 无水硫酸钠溶解后,用50 ml 乙腈溶液,振摇萃取,静置分层后,收集有机相,共萃取3 次,合并有机相。40 ℃真空条件下快速浓缩至5 ml 左右。

1.2.3 净化

土壤:提取液中加入0.4 g PSA 粉末,涡混2 min、5 000 r/min,离心5 min,上清液经5 g 无水硫酸柱除水后,于40 ℃真空条件下快速浓缩至近干。 1.0 ml 色谱纯乙腈定容、涡混1 min,4 000 r/min 离心3 min,上清液过0.22 μm 微孔滤膜,供UPLC-MS 测定。

养殖废水:提取液经5 g 无水硫酸柱除水后,于40 ℃真空条件下快速浓缩至近干。 1.0 ml 色谱纯乙腈定容,涡混1 min,过0.22 μm 微孔滤膜,供UPLC-MS 测定。

1.3 样品分析

1.3.1 色谱条件

色谱柱:岛津 C18(100 mm×2.1 mm ,2.0 μm);柱温:40 ℃;进样体积:1.0 μl;流速:0.20 ml/min;流动相:乙腈(A)和5 mmol/L 乙酸铵含0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱,0～0.5 min B 保持90 %;0.5～5 min B 由90%变化至75%;5～10 min B 由75%变化至50%;10 ～12 min B 保持50%;12～14 min B 由50%变化至90%;14～19 min B 保持90%。

1.3.2 质谱条件

离子源:ESI+ ;DL 温度:250 ℃;加热块温度:400 ℃;接口温度:300 ℃;接口电压:3.0 KV;雾化气流量:3.0 L/min;干 燥 气 流 量:10.0 L/min; 加 热 气 流 量:10.0 L/min。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的选择优化

比较了有机相(甲醇和乙腈),水相(水、0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸铵、5 mmol/L 乙酸铵含0.1%甲酸)的各种组合,分析了不同流动相组合对16 种磺胺的分离度,试验结果表明:乙腈+5 mmol/L 乙酸铵含0.1%甲酸水溶液作为流动相时,16 种磺胺经梯度洗涤完全分离且具有更好的峰值形状和更高的灵敏度,因此,本研究选择甲醇+0.1%甲酸水溶液作为流动相,此流动相条件下16 种磺胺类药物的保留时间和MRM 图如图1 所示。

图1 16 种磺胺类药物的保留时间和MRM 图Figure 1 Retention time and MRM of 16 quinolones

2.1.2 质谱条件的优化

首先对16 种浓度为0.1 μg/ml 的磺胺的单标标准液进行全扫描,根据峰高、峰形,以及干扰度等因素确定母离子、定量离子和定性离子,然后在MRM 模式下,对Q1 Pre Bias、Q3 Pre Bias、和CE 进行优化参数,最终确定质谱参数,如表1 所示。

表1 待测抗生素的质谱参数Table 1 Mass spectrum parameters of antibiotics to be tested

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

根据现有文献及标准,本方法对比了16 种分析物在不同提取溶剂(甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮)下的提取效果。 表2 的实验结果表明,采用乙酸乙酯和丙酮作为提取溶剂,16 种磺胺回收率不到60%,部分药物甚至低于50%,可能是磺胺类药物在乙酸乙酯和丙酮中的溶解性不好,提取率过低。 而使用乙腈和甲醇的提取效果具有明显优势,其中乙腈的提取效果最好,回收率为 65.4%～105.4%。 因此,本研究采用乙腈作为提取溶剂。

表2 不同酸性条件下16 种兽药的回收率Table 2 Recovery rate of 16 veterinary drugs under different acid conditions

2.2.2 净化方法的选择

QuEChERS 是最常见的用于检测食品中的多种药物残留的样品预处理方法。 由于养殖废水中含有畜禽粪便、饲料、抗生素等多种残留,基质较土壤更为复杂,因此,本研究以养殖废水为研究对象,针对其所含有的特殊杂质进行净化方法优化。 对比了QuEChERS 和MCX 固相萃取柱的净化效果。 根据图2 的实验结果,采用 MCX固相萃取柱净化的16 种磺胺其回收率明显低于QuECh-ERS 净化的回收率。 其中经过MCX 固相萃取柱净化的磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶等的回收率更是低于60%,这是因为净化过程中MCX 柱吸附了过多的化合物,导致回收率偏低。 使用QuEChERS 净化的16 种磺胺其回收率稳定为63.5%～105.4%。 所以本研究采用QuECh-ERS 作为净化方法。

图2 不同净化方法下16 种兽药的回收率Figure 2 Recovery rate of 16 veterinary drugs under different purification methods

2.2.3 基质效应(ME)

农田环境中养殖废水的成分最为复杂,虽然经过净化处理,但仍有部分杂质会与待测物一起随流动相进入质谱离子源,进而对目标化合物的离子化效果产生影响,从而导致基质效应(ME)。 图3 列出了16 种磺胺在养殖废水中的基质效应。 结果显示,ME 的范围为2.5%～36.2%,低于50%,表明养殖废水不存在强基质效应。 由图3 可知,磺胺醋酰和磺胺吡啶等具有基质减弱效应,磺胺噻唑和磺胺氯哒嗪等存在基质增强效应。 因此,本研究采用空白基质加标曲线来校正,以克服基质效应。

图3 16 种兽药的基质效应Figure 3 Matrix effect of 16 veterinary drugs

2.3 方法学验证

将空白基质按1.2 处理,并配制混合工作曲线。 16种磺胺的曲线范围如表3 所示,以被测组分的浓度为横坐标,被测组分的峰面积为纵坐标拟合工作曲线,得到相关系数、检出限和定量限。 结果见表3。 根据检出限的不同,分别添加检出限的1 倍、2 倍和10 倍制成模拟的加标样品,测定16 种的回收率、变异系数见表3。 实验结果表明16 种的相关系数均高于0.9933,回收率为65.4%～107.1%,相对标准偏差为3.2%～10.7%,方法检出限为0.03～0.6 μg/kg,定量限为0.1～2.0 μg/kg。

表3 16 种磺胺的曲线范围、相关系数、检出限、定量限、回收率、相对标准偏差Table 3 Curve range, correlation coefficient, detection limit, quantitation limit, recovery rate and relative standard deviation of 16 sulfonamides

2.4 实际样品检测

用本方法分别对养殖废水和周边土壤开展16 种抗生素检测,其中养殖废水样品 20 件、周边土壤样品20 件。16 种目标分析物在20 份养殖废水中有5 份样品中检出,20 份土壤中有3 份样品有检出。 检出的种类和含量如表4 所示。

表4 实际样品中16 种磺胺的残留量Table 4 Residues of 16 sulfonamide sin actual samples

3 结论

本研究建立了农田环境中同时测定16 种磺胺的超高效液相色谱—串联质谱测定方法,16 种磺胺的方法检出限0.03～0.6 μg/kg,定量限0.1 ～2.0 μg/kg。 该定性定量分析方法简便、快速、灵敏、重现性好,符合实验分析要求。 可同时检测16 种磺胺在农田环境中的残留。 扩大了磺胺类药物检测的基质,降低了检出限和定量限,可同时推广到行业其他实验室,具有一定的创新和推广价值。