离子色谱-串联质谱法测定茶叶中的氯酸盐和高氯酸盐

王 娟,谢雨泽,李 赞,陈 琛,王 敬,黄建辉,贾文轩

(河北省食品安全重点实验室,国家市场监管重点实验室(特殊食品监管技术),特殊食品安全与健康河北省工程研究中心,河北省食品检验研究院,河北 石家庄 050227)

中国出口欧盟的茶叶中频繁检出高含量的高氯酸盐,让氯酸盐和高氯酸盐受到密切关注[1-3]。氯酸盐和高氯酸盐主要作为清洁食品生产的杀菌剂的副产品出现[4]。随着氯酸盐和高氯酸盐的排放, 使其越来越多进入到环境中[5,6],因其极易溶于水[7],从而污染土壤及地下水, 随着地下水和地表水的流动, 被植物等吸收、积累, 经食物链进入人体[8,9]。研究表明,氯酸盐和高氯酸盐会阻碍甲状腺对碘的吸收, 尤其对于甲状腺功能障碍人群、缺碘患者、孕妇和婴幼儿,会严重影响其新陈代谢和生长发育[10-12]。因此,2020年欧盟委员会发布(EU)2020/685号条例,修订了高氯酸盐(perchlorate)在部分食品中的最大残留限量,其中,茶叶中高氯酸盐限量为0.75 mg/kg[13]。氯酸盐作为农药已不再被欧盟批准使用,其默认遵循标准(EU)2020/749 号条例中的相关规定,茶叶中的最大残留量为0.05 mg/kg[14]。

氯酸盐、高氯酸盐具有强极性、水溶性以及小分子的特点[3,15],常用的检测方法有比色法[16]、离子色谱法[17-19]、液相色谱-质谱联用[20-22]、离子色谱-质谱联用[23-25]等。本文利用离子色谱-串联质谱技术,建立检出限低,精密度良好,可准确定性和定量茶叶中氯酸盐和高氯酸盐含量的方法,为市场中茶叶的安全监管提供更有力的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯酸盐(1 000 mg/L,o2si公司)、高氯酸盐(1 000 mg/L,o2si公司)、氯酸盐-18O3(200 mg/L,EURL-SRM公司)、高氯酸盐-18O4(200 mg/L,EURL-SRM公司)。

RP柱(1cc,Agela公司)、Ag/H(1cc,Agela公司)、甲醇、乙腈(色谱纯,ThermoFisher科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

Dionex ICS-5000+离子色谱仪, EG淋洗液自动发生器,Dionex ASRS 300 (2 mm)微膜抑制器, AS-AP自动进样器(美国Thermo Scientific公司);TSQ Endura质谱仪(Thermo Scientific);涡旋混匀器,IKA;离心机,SiGMA 3K15;超声波清洗仪,ElmasonicP 300H;电子天平(美国Mettler Toledo公司);离心机(德国Merck公司);Milli-Q纯水(德国Merck公司);涡旋振荡器(德国Heidolph公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配置

实验前分别将氯酸盐、高氯酸盐用超纯水稀释成10 mg/L的储备液。将高氯酸盐-18O4、氯酸盐-18O3用超纯水稀释成1 mg/L的储备液。

1.3.2 样品前处理

称取2 g粉碎的茶叶样品粉末于50 mL 聚丙烯离心管中,加入 10 mL 纯水,涡旋 2 min,30 ℃震荡提取时间为 20 min。以8 000 r/min 离心 5 min,取1 mL上清液于10 mL容量瓶中,加入1 mL 乙腈,用纯水定容至刻度,摇匀,待净化。

取上述滤液经IC-RP柱、IC-Ag/H柱净化,弃去4 mL流出液,收集洗脱液,通过再生纤维素滤膜后待测。固相萃取柱使用前需进行活化,RP柱使用前依次用10 mL 甲醇、15 mL水通过,Ag/H柱用10 mL 水通过,均静置活化30 min[26]。

1.3.3 分析条件

1)离子色谱条件。色谱柱:Dionex IonPac AS 19-4 μm分析柱(250 mm×2 mm)、AG 19-4 μm保护住(50 mm×2 mm);流速为0.2 mL/min;进样量为100 μL;柱温为30 ℃;阴离子微膜抑制器,外接水循环模式,流动相:KOH溶液,采用梯度洗脱的方法进行分离,梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2)质谱条件。离子源:ESI-;扫描模式:MRM;负离子电离电压3000 V;离子传输管温度380 ℃;雾化器温度350 ℃;鞘气流速30 mL/min;辅助其流速10 mL/min;反吹气流速1 mL/min;Trace Finder 3.2 software数据分析软件;氯酸盐、高氯酸盐的质谱分析监测离子对、碰撞能量和去簇电压见表2。目标物质谱图如图1所示。

图1 氯酸盐、高氯酸盐标准溶液质谱图

表2 氯酸盐、高氯酸盐的质谱参数

2 结果与分析

2.1 离子色谱条件的选择

因为色谱柱需接入质谱仪,选择2 mm×250 mm色谱柱,同时配置2 mm阴离子抑制器。该方法比较了AS11-HC-4 μm,AS19-4 μm,AS16三种色谱柱,分别检测了10 ng/mL的混合标准样品和茶叶基质样品,发现相同条件下,AS11-HC-4 μm上标液高氯酸盐不能洗脱,AS19-4 μm,AS16均可实现分离,且AS16分析柱的保留时间提前,但是茶叶基质样品时氯酸盐存在干扰,因此选择AS19-4 μm作为分析柱。

2.2 质谱条件的选择

离子色谱仪的流动相为纯水,经KOH在线发生器后产生强碱KOH,后经过抑制器变为纯水,与质谱常用的甲醇、乙腈等有机溶剂相比,对检测物的离子化效率的促进作用较弱,因此在抑制器后,质谱进样口前接三通,利用计量泵输入有机溶剂,进入质谱促进电离。分别实验有机溶剂甲醇、乙腈,发现使用甲醇会增加抑制器背压,减少抑制器寿命,所以选用有机溶剂乙腈。计量泵的输入乙腈流速0.1 mL/min、0.15 mL/min、0.2 mL/min,发现0.15 mL/min、0.2 mL/min均可提高检测物的响应,考虑到抑制器的背压,计量泵流速选择0.15 mL/min。实验比较了50 ng/mL响应变化情况,结果见表3。

表3 氯酸盐、高氯酸盐的响应

2.3 前处理方法的选择

2.3.1 提取试剂的选择

目标物均属于强极性化合物,均极易溶于水,实验比较了纯水、50%甲醇水、40 mmol/LNaOH水溶液的提取效果,回收率结果如图2所示。结果显示,碱溶液提取时目标物的回收率低于其余两种提取液,50%甲醇水提取和纯水提取时目标物回收率均可达到实验室日常检测要求,而采用纯水提取时,目标物峰型更优,因此选择纯水作为提取溶剂。

图2 不同提取试剂的回收率

茶叶经纯水提取后,为减少颗粒物的影响,用纯水稀释10倍后再进行固相萃取净化,实际净化过程中发现过固相萃取柱时较困难,耗时费力,可能是茶叶基质复杂,蛋白、糖类、茶多酚含量较高,需要净化处理。根据文献报道[27-29],选取乙腈沉淀蛋白,离心过纤维素滤膜后,通过RP 固相萃取小柱吸附糖类等疏水物质,再通过Ag/H柱去除氯化物、微量重金属来提高敏感性、降低基线和获得更好的分离效果。

2.3.2 提取温度的选择

参考文献[25,30],实验选取了30 ℃、65 ℃、80 ℃下,震荡提取20 min,比较提取温度对提取效率的影响。在茶叶样品中添加125 μg/kg氯酸盐和250 μg/kg高氯酸盐,其结果见表4。3种温度下氯酸盐含量相对标准偏差为3.45%,高氯酸盐含量相对标准偏差为4.93%,表明提取温度对实验结果未有较显著影响,故选择30 ℃作为提取温度。

表4 不同提取温度下氯酸盐、高氯酸盐的含量

2.3.3 离心时间的选择

比较离心时间对提取效率的影响,采用建立的检测方法测定氯酸盐添加量为50 μg/kg,高氯酸盐添加量为100 μg/kg茶叶样品,当离心时间为5、10、15 min时,氯酸盐的测定值分别为 49.5、48.2、48.9 μg/kg,高氯酸盐的测定值分别为98.1、99.0、102.0 μg/kg。试验表明,离心时间对实验结果未有较明显影响。因此本实验选择8 000 r离心5 min。

2.4 线性范围及检出限

用纯水将分析物配置成0.02～200 ng/mL系列混和标准工作液,按照 1.3.3分析条件进样分析。发现氯酸盐在0.08～200 ng/mL,高氯酸盐在0.04～100 ng/mL范围内线性良好,均可符合实验要求。以3倍噪声为检出限,计算得到氯酸根检出限为 1.0 μg/kg ,高氯酸根检出限为0.5 μg/kg;以 10 倍噪声的浓度为定量限,计算得到氯酸根定量限为 4.0 μg/kg ,高氯酸根定量限为2.0 μg/kg,结果见表5。

表5 线性范围及检出限、定量限

2.5 回收率与精密度

称取多份茶叶基质,氯酸盐分别添加25、50、125μg/kg;高氯酸盐分别添加50、100、250μg/kg,对氯酸盐和高氯酸盐进行回收率和精密度的考察。每个添加浓度水平下做 6个平行样品。方法的精密度及回收率数据见表6。结果显示所建方法各项性能参数均满足检测需求。

表6 氯酸盐、高氯酸盐的加标回收率和精密度

2.6 市售样品的检测

按照1.3节中实验方法对从市场随即采购的20种茶叶(8批次绿茶、4批次红茶、4批次铁观音、1批次白茶、2批次黑茶、1批次莓茶)进行测定,样品中氯酸盐、高氯酸盐含量结果见表7。结果显示,茶叶中均检出氯酸盐和高氯酸盐,氯酸盐在9.34～86.5 μg/kg。有1批次绿茶的氯酸盐超过欧盟最大残留量;高氯酸盐在2.69～106 μg/kg,均符合欧盟的要求。试验结果表明茶叶中氯酸盐有超限量的风险,危害消费者权益和健康,需要引起监管部门关注,建立风险抽检检测预案,因此,建立茶叶中氯酸盐和高氯酸盐含量的检测方法具有实际应用价值。

表7 市售茶叶中氯酸盐、高氯酸盐测定结果

3 结论

本文采用离子色谱-串联质谱技术同时测定茶叶中氯酸盐和高氯酸盐的含量。通过纯水提取,固相萃取净化,操作简单,经方法学验证具有回收率高,检出限低,精密度良好等特点,可准确定性和定量茶叶中氯酸盐和高氯酸盐,为我国进出口茶叶的风险监测提供了一种新的技术手段。