Th1/Th2 免疫平衡偏移介导JAK2-STAT3 信号通路参与感染性早产发生机制研究

杜凌颖，李忠连，杨琼艳，佀艳婷，郭 颖

（1.大理大学第一附属医院，云南大理 671000；2.大理白族自治州妇幼保健院，云南大理 671000）

早产是指妊娠满28 周而不足37 周的分娩〔1〕，每年全球早产儿分娩量约为1 500 万，早产平均发生率高达10%，高居妊娠并发症首位〔2〕。感染是早产的主要危险因素之一，在引起早产的众多病因中，感染约占25%～40%〔3〕。感染性早产发病机制尚不清楚，近年来相关研究聚焦于机体过度炎症反应及免疫平衡调节，妊娠过程中免疫平衡被打破引起的过度炎症及炎症因子的过度分泌可能是感染性早产发生的关键。辅助性T 细胞（helper T cell，Th细胞）根据其分泌不同细胞因子被划分为Th1 和Th2，Th1/Th2 免疫平衡是机体炎症调节的关键，也与正常妊娠的维持密切相关。正常妊娠产妇体内Th1/Th2 免疫平衡表现为Th2 占主要优势，国内外研究证实，Th1/Th2 免疫平衡的病理性失衡将导致复发性流产、妊娠期高血压、妊娠期糖尿病等不良妊娠结局〔4〕，但Th1/Th2 免疫平衡参与感染性早产的具体机制尚不清楚。Th1/Th2 免疫平衡失衡可引起肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6 等炎症因子异常表达，这些炎症因子均参与了妊娠过程，研究〔5〕发现感染性早产产妇外周血及羊水中均存在这些炎症因子的异常高表达。IL-6 的生物学功能主要通过Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信号转导及转录激活因子3 （signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信号通路实现，同时JAK2-STAT3 信号通路作为机体炎症调控的重要通路，也参与了正常妊娠的维持。本研究通过测定早产及足月分娩产妇外周血清中细胞因子干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-4、IL-6、TNF-α 表达水平以及胎膜组织中STAT3、核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）表达水平，探讨Th1/Th2 免疫平衡偏移情况及其介导的JAK2-STAT3 信号通路传导与感染性早产发生的机制，寻求其内在的生物学功能和病理损伤相关性，揭示感染性早产炎症调控信号通路，为对症预防策略提供新的治疗靶点，并筛选具有临床价值的诊断因子。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020年5月至2021年10月就诊于大理大学第一附属医院的早产患者60 例为研究对象，将其纳入早产组，根据早产组患者产后胎膜组织病理检查结果分为感染性早产组（n=34）和非感染性早产组（n=26）。纳入标准：①自然受孕、单胎、孕周明确、分娩孕周为28+0～36+6周者；②分娩方式为自然分娩、临产后因产程异常或胎儿窘迫行剖宫产术者。排除标准：①高龄产妇；②习惯性流产者；③合并有胎盘早剥、前置胎盘、妊娠期高血压、妊娠期肝内胆汁淤积症、妊娠期糖尿病以及合并甲亢、心脏病等妊娠期合并症及并发症者；④产前有外伤、性交史者；⑤近3 周有绒毛膜羊膜炎之外的其他急慢性感染性疾病者。将同期就诊于大理大学第一附属医院的正常足月分娩、无其他妊娠期疾病及合并症的单胎妊娠产妇20 例纳入正常对照组。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 采集产妇分娩发动时的外周血，离心后取上清液，-80 ℃保存待测；产妇排出胎盘后，剪取破口处3 cm×3 cm 全层胎膜组织1 块，24 h内经10%中性甲醛固定，石蜡包埋待测。

1.2.2 外周血清检测 血清标本恢复至室温，采用ELISA 试剂盒检测IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6 表达水平，以上试剂盒均购自泉州睿信生物科技有限公司。IFN-γ 代表Th1 型细胞因子，IL-4 代表Th2 型细胞因子，用IFN-γ/IL-4 表示Th1/Th2 免疫调节平衡指数（以下简称“平衡指数”）。

1.2.3 胎膜组织检测 胎膜组织石蜡切片经苏木精-伊红染色后由2 位经验丰富的病理科医师进行双盲阅片，根据炎症细胞浸润及组织结构改变程度，诊断胎膜组织是否存在绒毛膜羊膜炎。胎膜组织石蜡切片按照免疫组织化学染色法检测STAT3、NF-κB 蛋白在胎膜组织中的表达情况。免疫组织化学结果判定：细胞中未出现棕黄色颗粒者为阴性细胞，反之为阳性细胞，根据阳性细胞显色强度进行分级，其中，黄色为弱阳性（计1 分）、棕黄色为阳性（计2 分）、深棕黄色为强阳性（计3 分）。使用Image-ProPlus 图像分析软件进行图像分析，每张切片随机选取5 个视野，观察高倍视野中的所有细胞，记录阳性染色细胞百分数，其中，0%～1%计0分、2%～10%计1 分、11%～50%计2 分、51%～80%计3 分、81%～100%计4 分。免疫组织化学评分（IHS值）=阳性细胞显色强度计分×阳性染色细胞百分数计分。

1.3 统计分析 采用GraphPad Prism 9.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用（x± s）描述，使用单因素方差分析（方差齐）或Brown-Forsythe方差分析（方差不齐）进行比较；不符合正态分布的计量资料用［M（Q）］描述，使用K-W 秩和检验进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料比较 各组产妇年龄、孕次比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。早产组产妇孕周明显少于正常对照组产妇，差异有统计学意义（P＜0.05）；感染性早产组与非感染性早产组产妇孕周差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 临床资料比较（x±s）

2.2 外周血清IFN-γ、IL-4 表达水平及平衡指数比较 与正常对照组比较，早产组的IFN-γ 水平显著升高，IL-4 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与非感染性早产组比较，感染性早产组的IFN-γ 水平显著升高，IL-4 水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。比较各组平衡指数可知，感染性早产组显著高于其他2组，非感染性早产组显著高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。上述结果表明，在早产组中，尤其是感染性早产组，Th1/Th2 免疫平衡具有明显向Th1 方向偏移趋势。见表2。

表2 IFN-γ、IL-4 表达水平及平衡指数比较（x±s）

2.3 外周血清TNF-α、IL-6 表达水平比较 感染性早产组的TNF-α、IL-6 水平显著高于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与正常对照组比较，非感染性早产组的TNF-α 水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），但IL-6 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 TNF-α、IL-6 表达水平比较（pg/mL，x±s）

2.4 胎膜组织病理学改变 感染性早产组胎膜组织满视野遍布中性粒细胞浸润，部分浸润蜕膜绒毛膜，并有羊膜组织水肿，且部分细胞已破裂溶解，组织正常形态消失；非感染性早产组和正常对照组胎膜组织均未见明显中性粒细胞浸润，细胞排列整齐，组织完整性好，羊膜层无水肿。见图1。

2.5 胎膜组织中STAT3、NF-κB 表达水平比较 感染性早产组的STAT3、NF-κB 水平显著高于其他2组，差异有统计学意义（P＜0.01）；与正常对照组比较，非感染性早产组的STAT3、NF-κB 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4，图2～3。

图2 胎膜组织中STAT3 表达

图3 胎膜组织中NF-κB 表达

表4 STAT3、NF-κB 表达水平比较（IHS 值）

3 讨论

早产发生率居高不下，严重威胁母婴健康。感染是早产的主要危险因素之一〔2〕，但感染性早产发病机制尚不清楚，探究感染性早产发病机制，寻求其内在的生物学功能和病理损伤相关性至关重要。分娩的最终发动机制是前列腺素的合成及分泌，而基质金属蛋白酶、促肾上腺皮质激素释放和细胞因子表达等也在分娩发动中起到协同作用〔6-7〕，当孕妇机体出现过度炎症反应，往往会导致未足月分娩发动，孕妇机体的炎症反应及免疫调节可能是感染性早产发病机制的关键。Th1/Th2 免疫平衡及JAK2-STAT3 信号通路作为机体免疫调节的关键，在妊娠维持中扮演着重要角色。TNF-α 和IL-6 是目前被广泛研究，且已被证实与妊娠结局密切相关的炎症因子，TNF-α 作为典型Th1 型细胞因子，可通过激活Toll 样受体4（Toll-like receptor-4，TLR4）-NF-κB 信号通路促进IL-6 的合成与分泌，而IL-6作为机体重要的炎症因子，同时也是Th2 型细胞因子，其大部分生物学功能均需通过激活JAK2-STAT3 信号通路实现。由此推测，Th1/Th2 免疫平衡与JAK2-STAT3 信号通路可能通过某种相互作用，共同参与到感染性早产发病中，但其具体的作用方式及造成的影响尚不清楚，需进行深入探索。

Th1 主要介导细胞免疫，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β 等炎症因子；Th2 主要介导体液免疫，分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10 等抗炎因子〔8〕。Th1、Th2 分泌的多种细胞因子共同构建了复杂的细胞因子网络，维持着母胎免疫平衡，保证妊娠正常进行。近年来，国内外研究均发现正常妊娠的母体免疫微环境表现为“Th2 偏移”现象〔9〕，且Th1/Th2免疫平衡向Th1 方向偏移往往与不良妊娠结局有关。Salek 等〔10〕研究表明在复发性流产小鼠模型外周血中同时存在Th1 型细胞因子的明显高表达及Th2 型细胞因子的明显低表达；周美茜等〔11〕在胎膜早破产妇单个外周核细胞中也发现Th1 型细胞因子表达水平较正常妊娠产妇明显升高，而Th2 型细胞因子表达水平则明显降低，且发生胎膜早破的孕周越小，Th1 型细胞因子的高表达越明显。在本研究中，早产组产妇的外周血清中Th1 型细胞因子IFNγ、TNF-α 表达水平均较正常对照组升高，且伴有感染时，细胞因子高水平表达结果更显著；同时Th2型细胞因子IL-4 在早产组产妇的外周血清中出现了表达下降现象，且在感染性早产组中下降更明显。综上所述，无论早产产妇是否伴有感染，Th1/Th2免疫平衡均向Th1 方向偏移，而当早产产妇伴有感染时，这种偏移更加明显。具体机制可能是当母体受到外来病原体攻击时，机体细胞免疫加强，Th1 型细胞活跃，分泌大量IFN-γ、TNF-α 等炎症因子，诱发机体过度炎症反应，同时过度表达的IFN-γ 可抑制Th2 型细胞功能，使IL-4、IL-10 等抗炎因子表达水平降低，进一步加剧了机体炎症反应的失调。在Th1 型细胞高表达和Th2 型细胞低表达的共同作用下，Th1/Th2 免疫平衡向Th1 方向严重偏移，机体炎症反应失控，最终引起分娩发动，从而导致感染性早产的发生。

值得注意的是，IL-6 作为一种多效应的Th2 型细胞因子，因其能调控多种炎症急性期反应蛋白的转录，主要效应表现为增强炎症反应，故被划分为炎症因子〔12〕。IL-6 参与正常妊娠的全过程，随着孕期的延长，IL-6 表达水平逐渐增长。IL-6 在感染性早产中也发挥着重要作用，当病原体侵犯羊膜腔，机体启动免疫反应，蜕膜、绒毛膜、羊膜等妊娠组织产生大量的IL-6 等炎症因子，促进前列腺素的合成与分泌，促使宫颈成熟，诱发宫缩，导致早产。Gomez-lopez 等〔5〕研究发现，在合并绒毛膜羊膜炎的早产产妇的羊水中，IL-6 表达水平显著高于无绒毛膜羊膜炎的产妇，且感染性胎膜早破的产妇血清中IL-6 含量显著升高，而未合并感染的胎膜早破产妇血清中IL-6 含量无明显升高。

NF-κB 相关信号通路的激活是引起IL-6 释放的关键因素。NF-κB 是一种免疫反应蛋白，可作为转录调控因子参与机体炎症应答及调节。Catalano等〔13〕研究证实宫内感染会通过诱导NF-κB 激活造成炎症因子与抗炎因子平衡被破坏，从而诱发早产。在TNF-α 等炎症因子刺激下，TLR4-NF-κB 信号通路被激活，炎症调控因子NF-κB 发生核转移，与靶基因启动子或增强子上的NF-κB 结合序列结合，激活IL-6 等多种促炎因子的相关基因，导致IL-6 等炎症因子的表达水平升高〔14〕，反之，IL-6 的释放亦能增强NF-κB 的活化〔15〕。本研究中胎膜组织中NF-κB 表达水平变化趋势与外周血清中IL-6相同，二者在感染性早产产妇体内均出现了显著高表达，但在非感染性早产产妇体内二者表达水平与正常足月分娩产妇差异无统计学意义。该结果进一步证实了在感染性早产产妇体内不仅存在Th1/Th2免疫平衡向Th1 方向的病理性偏移，且高表达的Th1 型细胞因子TNF-α 等还通过激活TLR4-NFκB 信号通路进一步促进IL-6 等相关炎症因子的大量合成分泌，引发联级炎症反应失控。

近年来，感染性早产发病机制的相关研究多聚焦于母胎界面免疫微环境及相关分子信号通路，包括JAK-STAT、TLR4-NF-κB 以及环氧合酶2 等多条信号通路。母胎界面主要由胎膜、蜕膜及子宫组成，一旦母胎界面微环境免疫平衡失调，产生过度炎症，将直接引发宫颈软化、宫缩发动及胎膜早破等系列反应，最终导致早产发生。JAK2-STAT3 信号传导通路作为近年来被广泛研究的、最典型的炎症相关信号通路之一，在母胎界面免疫调节及正常妊娠的维持中至关重要。JAK2-STAT3 信号通路由JAK 相关受体、JAK、STAT 三部分组成，JAK 是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，其本质为蛋白质，其中JAK2 广泛存在于机体各种组织细胞中，主要作用是介导配体和受体间信号传导；STAT3 是STAT 蛋白家族中的一员，与JAK2 共同形成了JAK2-STAT3 信号转导通路〔16〕。JAK2-STAT3 信号通路的正常激活在维持正常妊娠中不可缺少，Hiraoka等〔17〕研究发现孕鼠的子宫上皮细胞及基质细胞中均存在STAT3 的高表达，且通过不同的途径协同控制子宫的容受性和胚胎着床过程，而敲除STAT3 基因的小鼠会表现出胚胎着床失败；Nakamura 等〔18〕研究发现当孕鼠体内STAT3 的活性与传导受到抑制，将出现胚胎吸收现象。本研究发现在感染性早产组的胎膜组织中，STAT3 表达水平显著高于非感染性早产组和正常对照组，且非感染性早产组的STAT3 表达水平较正常对照组比较差异无统计学意义，即感染性早产产妇母胎界面存在JAK2-STAT3 信号转导通路的异常激活。STAT3 表达水平变化趋势与IL-6、NF-κB 一致。

本研究发现：在感染性早产组中，产妇机体内Th1/Th2 免疫平衡表现为向Th1 方向的病理性偏移，外周血清中IL-6、TNF-α 及胎膜组织中NFκB、STAT3 表达水平异常升高；然而，在非感染性早产组中，产妇体内Th1/Th2 免疫平衡虽也表现为向Th1 方向的病理性偏移和TNF-α 的高表达，但IL-6、NF-κB、STAT3 表达水平较正常对照组差异无统计学意义。由此可见，Th1/Th2 免疫平衡可通过TNF-α、NF-κB、IL-6、JAK2-STAT3 信号传导从而介导JAK2-STAT3 信号通路参与感染性早产的发生，这种信号转导仅在感染性早产中被发现。机制可能是发生感染时，宿主的巨噬细胞和妊娠组织的淋巴细胞被激活，Th1/Th2 免疫平衡向Th1 方向发生偏移，TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8 等促炎因子和前列腺素E2 和F2，以及基质金属蛋白酶合成增加，高表达的IFN-γ 抑制了Th2 细胞功能，导致Th2 型细胞因子IL-4 表达明显降低，进一步加剧了Th1/Th2 免疫平衡向Th1 方向偏移，使机体免疫平衡失调加重。大量分泌的TNF-α 通过激活TLR4-NF-κB 信号通路促进IL-6 的过量分泌〔14〕，在过量IL-6 的刺激下，JAK2-STAT3 信号通路信号延长，活化的JAK2-STAT3 通路可促使CD4+T 淋巴细胞表达维甲酸相关孤核受体-γt，进而使之分化为Th17 细胞，Th17 细胞可促进其他炎症细胞释放IL-6、TNF-α 等炎症因子，进一步放大炎症反应〔19〕，机体免疫平衡失调及过度炎症反应最终导致感染性早产的发生。

综上所述，本研究发现在感染性早产组中，产妇体内Th1/Th2 免疫平衡可通过TNF-α、NF-κB、IL-6、JAK2-STAT3 信号传导从而介导JAK2-STAT3 信号通路参与感染性早产的发生，但由于本研究纳入的样本量相对较少，且未在非感染性早产组中发现该信号转导现象，需进一步探究出现该差异的原因。