云南松松塔抗HIV 活性提取物对人冠状病毒229E抑制活性的研究

李亚飞，尚方建，罗春雨，石哲芳，刘 奇

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000；3.首都医科大学附属北京儿童医院保定医院，河北保定 071000）

新型冠状病毒在全球范围的传播引起了科研人员对冠状病毒（coronavirus，CoV）新一轮的研究热潮。冠状病毒亚科分为α、β、γ、δ 4 个属，β 属由A、B、C、D 4 个亚群组成〔1〕。至今为止，科研人员先后从患者体内发现了7 种可引起人类患病的人冠状病毒（human coronavirus，HCoV），分别为α 属的HCoV-229E 和HCoV-NL63，A 亚群的HCoV-OC43和HCoV-HKU1，B 亚群的SARS-CoV 和SARSCoV-2，C 亚群的中东呼吸综合征病毒〔1-2〕。普通冠状病毒229E、OC43 和NL63 能引起人上呼吸道感染，是导致近三分之一普通感冒的病因〔3〕。尽管普通冠状病毒感染的症状不严重且能自愈，但会导致儿童、老年人和免疫功能低下患者产生严重甚至致命的疾病〔2，4〕。松塔为松科植物的果球，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和增强免疫功能的作用，有较高的研究价值〔5-6〕。云南松主要分布在中国西南地区，研究〔7〕发现云南松松塔提取物对HIV-1ⅢB、HIV-1RF、HIV-1A17等病毒株具有抑制效果，然而其是否具有抗冠状病毒的活性尚无相关报道。

本研究通过建立HCoV-229E S 蛋白介导的细胞-细胞融合模型和假病毒模型，探究云南松松塔抗HIV 活性提取物（以下简称“松塔提取物”）对HCoV-229E 的抑制活性，并初步明确其活性部位和作用机制，为松塔药物后续活性单体追踪及抗HCoV-229E 机制研究奠定基础，丰富云南松松塔的医学研究价值和经济价值，为抗冠状病毒天然药物研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒、细胞 感受态细菌（DH-5α）购自天根生物科技有限公司（批号：CB101-02）；293T、Huh-7 细胞、表达绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的克隆载体质粒pAAVIRES-EGFP、质粒pNL4-3.luc.R-E（编码env 缺陷，含有萤火虫酶报告基因的HIV-1 骨架质粒）、表达HCoV-229E S 蛋白的重组真核表达质粒pCDNA3.1-229E-S、共表达S 蛋白和EGFP 的重组质粒pAAV-IRES-EGFP-229E-S 均由本实验室团队前期成功构建保存。

1.1.2 主要试剂 大提质粒试剂（天根生化科技有限公司，批号：DP117）；EZ Trans 细胞转染试剂（上海李记生物科技有限公司，批号：AC04L091）；萤火虫酶检测系统试剂盒、细胞裂解液（Promega公司，批号：E1501、E153A）；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0212、PW1001）；DAPI 溶液（北京索莱宝科技有限公司，批号：C0065）；PBS、青链霉素混合液、CCK-8 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：P1020、MA0110、MA0218-L）；松塔提取物由大理大学药学院刘光明教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 293T 细胞与靶细胞Huh-7 均采用含10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的高糖DMEM 完全培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养。转染前12 h 将293T 细胞以8×106个/孔铺于6孔板，待细胞密度达70%～80%且形态良好时，采用EZ Trans 转染试剂按说明书操作进行质粒pAAVIRES-EGFP-229E-S 转染，继续培养24～48 h 后得到稳定共表达HCoV-229E S 和EGFP 蛋白的效应细胞（293T/229E/EGFP），转染质粒pAAV-IRESEGFP 作为阴性对照细胞（293T/EGFP）。

1.2.2 细胞-细胞融合模型建立 融合前1 d 将Huh-7 细胞以3×104个/孔铺于96 孔板培养12 h。融合前2 h 加入20 μL DAPI 溶液作用20 min，进行Huh-7 细胞和293T/229E/EGFP 细胞核染色，PBS 洗净DAPI 溶液后将293T/229E/EGFP 和293T/EGFP 以每孔约1×104个荧光细胞与Huh-7 细胞共培养，分别作为实验组和阴性对照组，于不同时间段用荧光显微镜观察细胞-细胞融合情况，计算细胞-细胞融合率。细胞-细胞融合率=（1-n1/n0）×100%（式中n1表示不同融合时间后单个荧光细胞数；n0表示融合前单个荧光细胞数），绘制时间融合关系曲线。

1.2.3 假病毒HCoV-229E 包装及靶细胞感染 假病毒包装主要步骤如下：按1 ∶2 比例将质粒pCDNA3.1-229E-S 与pNL4-3.luc.R-E 共转染于293T 细胞，10～12 h 后将液体更换为DMEM 完全培养基。48～72 h 后，收集细胞培养液，3 000 r/min 离心10 min，去除细胞沉淀，取上清液分装后于-80 ℃保存备用。感染靶细胞主要步骤如下：感染前12 h于96 孔板中铺入靶细胞Huh-7，2×104个/孔，PBS洗涤细胞2 次，每孔加入100 μL 用1∶2 DMEM 稀释的假病毒，感染10～12 h 后，更换为DMEM。培养48～72 h，用PBS 洗涤2 次，每孔加40 μL 细胞裂解液，100 r/min 振荡裂解30 min，取裂解后的液体20 μL 于96 孔板中，加20 μL 萤火虫酶底物，混匀后检测荧光值。

1.2.4 抑制活性检测 细胞-细胞融合抑制活性检测以293T/229E/EGFP 与Huh-7 细胞共培养作为阳性对照组；293T/EGFP 与Huh-7 细胞共培养作为阴性对照组；梯度稀释松塔提取物和293T/229E/EGFP在37 ℃、5% CO2条件下孵育1 h 与Huh-7 细胞共培养作为实验组。假病毒抑制活性检测以HCoV 细胞-229E 假病毒与Huh-7 细胞共培养作为阳性对照组；无假病毒和松塔提取物作为阴性对照组；假病毒梯度稀释松塔提取物37 ℃孵育1 h 与Huh-7细胞共培养为实验组，按“1.2.3”项下方法检测荧光值，计算抑制率。抑制率=［1-（E-N）/（P-N）］×100%（式中E 表示实验组的细胞-细胞融合率或荧光值；P 和N 分别表示阳性对照组和阴性对照组的细胞-细胞融合率或荧光值）。以松塔提取物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘制药物抑制曲线，使用Calsusyn软件计算半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.5 时间-移除实验 松塔提取物分别与293T/229E/EGFP、Huh-7 细胞共孵育1 h，洗除未结合的药物，将两者共培养，观察是否仍具有抑制作用，初步检测其作用靶点。实验组分为3组：组1 为松塔提取物与293T/229E/EGFP 作用1 h，与Huh-7 细胞共培养；组2 为松塔提取物与293T/229E/EGFP 作用1 h，用DMEM 洗涤细胞2 次去除未结合的药物，与Huh-7 细胞共培养；组3 为松塔提取物与Huh-7细胞作用1 h，用DMEM 洗涤细胞2 次去除未结合的药物，与293T/229E/EGFP 共培养。不加松塔提取物293T/229E/EGFP 与Huh-7 细胞直接共培养作为阳性对照组；293T/EGFP 与Huh-7 细胞共培养作为阴性对照组，测定荧光值，按“1.2.4”项下方法计算抑制率。

1.2.6 时间-添加实验 293T/229E/EGFP 与Huh-7细胞共孵育，分别于0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h 加入松塔提取物作为实验组；不加松塔提取物293T/229E/EGFP 与Huh-7 细胞直接共培养作为阳性对照组；293T/EGFP 与Huh-7 细胞共培养作为阴性对照组，测定荧光值，按“1.2.4”项下方法计算抑制率。

1.2.7 细胞增殖毒性检测 按CCK-8 试剂说明书操作，测定松塔提取物对293T、Huh-7 细胞的毒性作用。酶标仪测定450 nm 处的吸光度（OD）值，计算细胞毒性率。细胞毒性率=［（OD实验-OD空白）/（OD对照-OD空白）］×100%。

2 结果

2.1 细胞-细胞融合模型的构建 实验结果显示，3 h 后于荧光显微镜下可观察到实验组产生明显的细胞-细胞融合现象，同一荧光强度下与未融合的细胞比，荧光强度弱且形状不规则，阴性对照组没有融合现象。见图1A。48 h 后荧光视野下实验组有大面积融合现象，DAPI 染色可见融合区域有多个细胞核。见图1B。说明HCoV-229E S 蛋白会介导细胞-细胞融合现象的发生，细胞-细胞融合模型构建成功。于不同时间观察同一视野细胞-细胞融合情况，绘制时间融合关系曲线，由时间融合关系曲线可知6 h 后，实验组细胞-细胞融合率达到50%。见图2。

图1 HCoV-229E S 蛋白介导的细胞-细胞融合情况

图2 时间融合关系曲线

2.2 松塔提取物对HCoV-229E 的抑制作用 利用细胞-细胞融合模型检测松塔提取物对HCoV-229E的抑制活性，6 h 后观察各组细胞-细胞融合情况，计算抑制率并绘制抑制曲线，结果显示：松塔提取物能以剂量依赖方式有效抑制由HCoV-229E S 蛋白介导的细胞融合现象发生。见图3A。松塔提取物浓度为2 mg/mL 时，能抑制75%的细胞融合，IC50为（0.136±0.010）mg/mL，而不加松塔提取物的阴性对照组没有抑制作用。假病毒模型检测结果显示：松塔提取物能抑制HCoV-229E 假病毒感染，在1 mg/mL 时对HCoV-229E 假病毒感染的抑制率达到90%，且以剂量依赖方式有效抑制感染，IC50为（0.069±0.015）mg/mL。见图3B。实验结果表明松塔提取物能有效抑制HCoV-229E 的进入。

图3 松塔提取物抑制曲线

2.3 时间-移除实验结果 实验组1 松塔提取物与293T/229E/EGFP 作用1 h 后直接加入Huh-7 细胞中，抑制率为（82.10±5.30）%。实验组2 松塔提取物仅与293T/229E/EGFP 作用，以明确药物作用靶点是否在S 蛋白上，抑制率为（77.25±4.92）%。实验组3 松塔提取物仅与Huh-7 细胞作用，明确药物作用靶点是否在靶细胞的受体上，抑制率为（25.28±3.07）%。由此可见，松塔提取物抑制活性靶向HCoV-229E 的S 蛋白。

2.4 时间-添加实验结果 共培养293T/229E/EGFP 和Huh-7 细胞后，于不同时间加入松塔提取物，观察其抑制活性，结果显示：融合初始阶段加入松塔提取物抑制活性能达到60%，随着时间的推移，抑制活性逐渐降低，2.0 h 后，抑制活性只达到10%，说明松塔提取物作用时间在HCoV-229E 感染的早期。见图4。

图4 松塔提取物作用时间检测

2.5 细胞毒性检测结果 检测了松塔提取物的细胞毒性率，结果显示：不同浓度松塔提取物对293T及Huh-7 细胞没有明显毒性作用。见表1。

表1 松塔提取物对293T、Huh-7 细胞的细胞毒性率（%，x±s）

3 讨论

在新型冠状病毒全球传播的大背景下，虽然针对冠状病毒的疫苗研发技术在迅速发展，但药物研究方面迄今为止仍没有针对SARS-CoV-2 或其他冠状病毒的有效药物〔8-9〕，因此急需研究开发新的治疗药物。

松塔含许多天然化合物，具有抗病毒、免疫增强、抗肿瘤等多种作用〔10-11〕，有极其广泛的药用价值。云南松主要分布在中国西南地区，其松塔中的木质素-碳水化合物复合物具有多种药理特性。张海珠等〔12〕于云南松松塔提取物中发现并提取了木质素，分析证明其与抗HIV 作用有关；崔雪青等〔13〕采用合胞体抑制实验等方法证明了思茅松松塔提取物SMS-F 能作用于HIV-1 进入融合阶段，从而阻断合胞体的形成，具有很好的抗HIV-1 活性。多项研究〔6，14〕表明，天然的木质素对流感病毒、HIV-1、轮状病毒、单纯疱疹病毒、肠病毒的生长均有抑制作用，具有多方面的抗病毒活性。基于此，本研究进一步对松塔提取物的抗HCoV-229E 的活性进行评价，并探讨了其作用机制。

S 蛋白是研究抗冠状病毒进入抑制剂药物及疫苗的主要靶点之一。其中进入抑制药物可以通过阻断S1 与相应受体的结合，或靶向S2 抑制其6-HB的形成，从而阻断病毒包膜与靶细胞细胞膜的融合进程，最终抑制冠状病毒的感染。本研究成功构建了由HCoV-229E S 蛋白介导的可视化细胞-细胞融合模型，制备了HCoV-229E 假病毒，以检测松塔提取物对HCoV-229E 的抑制活性。结果显示：松塔提取物能有效抑制由HCoV-229E S 蛋白介导的细胞-细胞融合（IC50：0.136±0.010 mg/mL），同时能有效抑制HCoV-229E 假病毒对靶细胞的感染（IC50：0.069±0.015 mg/mL）。进一步通过时间-添加实验以及时间-移除实验研究作用时间及作用靶点，结果表明松塔提取物作用是在病毒感染的早期，靶向S 蛋白。

综上所述，本研究初步建立了一种安全性高的抗HCoV-229E 感染活性体外检测模型，对松塔提取物抗HCoV-229E 活性作出评价并研究其机制。结果显示：松塔提取物具有较强的抗HCoV-229E活性和低细胞毒性。松塔具有来源广泛及廉价易取的特点，适宜量产，有望成为抗冠状病毒的候选药物之一，但其具体机制和体内抗HCoV-229E 病毒活性和毒性有待进一步评价。