MMP-2 响应的多肽修饰的PAMAM 纳米颗粒负载DOX 在乳腺癌细胞中的效应

顼嘉琪 刘克海

上海海洋大学食品学院（上海 201306）

纳米颗粒（nano particles，NPs）通过高渗透长滞留（enhanced permeability and retention，EPR）效应实现化学治疗（化疗）药物的靶向递送，已经成为癌症治疗诊断的有前途的工具［1］。通常，纳米制剂的整个体内递送过程包括血液循环、肿瘤累积、滞留、渗透、细胞内化和清除［2］。在这些过程中，NPs的转运受到许多生物屏障的阻碍，例如网状内皮系统的相互作用和肿瘤的高间质液压力。理想的药剂应该能够积聚到肿瘤中，有效地发挥作用，并且在其功能耗尽后从体内消除，以避免长期毒性［3］。为了实现最佳的治疗诊断性能，应合理设计纳米颗粒的结构和性质以实现有效递送。作为NPs的基本性质，粒径在递送过程中起重要作用。为了实现延长的血液循环和高肿瘤积聚，直径在20~200 nm范围内的NPs是一个很好的选择，因为它有助于通过EPR效应在肿瘤部位蓄积［4］。然而，该尺寸范围对于肿瘤保留、渗透和机体消除不是最佳的。为了防止NPs重新进入血流或扩散到周围组织中，可以将大尺寸的NPs捕获到肿瘤部位中；而需要较小的尺寸来实现令人满意的穿透深度或快速清除［5］。因此，理想的递送系统的初始尺寸应该相对较大，以实现更长的循环和选择性外渗，但是一旦“对接”在肿瘤部位，它应该可切换为小颗粒以促进肿瘤渗透［6］。这些设想促进了刺激响应性纳米颗粒的发展，这些纳米颗粒能够通过响应酶、pH或其他条件来缩小其尺寸［7］。

基于此，为了克服尺寸所引发的递送障碍，本文设计了一种酶响应型纳米递送系统，该系统由金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）敏感多肽交联负载化疗药物的小粒径载体PAMAM/DOX构成。聚酰胺-胺树状大分子（polyamidoamine dendrimer，PAMAM）是目前被广泛研究的阳离子聚合物，其尺寸较小，表面富含大量氨基，易于后续修饰，且疏水空腔内可以负载化疗药物［8］。此外，PAMAM表面的氨基质子化，在溶酶体中产生“质子海绵效应”，使得其从溶酶体中逃逸并进入细胞质中。肿瘤细胞及其外基质中高表达MMP，针对此在药物递送系统中引入酶敏感多肽片段，可实现药物尺寸的变化［9］。本研究合成了MMP-2敏感多肽pep（CPLGVRGC），用于交联超小粒径纳米颗粒形成大尺寸递送系统［10］。该递送系统的初始尺寸约为200 nm，有利于其通过EPR效应在肿瘤部位积累，一旦它们到达肿瘤部位，在肿瘤组织中高表达的MMP-2刺激下，其转化为尺寸约为10 nm的小粒径颗粒，实现化疗药物阿霉素（Doxorubicin，DOX）靶向递送。本研究对所合成材料进行表征，并进一步对其药物释放率、体外对小鼠乳腺癌细胞的抑制效果、细胞摄取效果、靶向性以及可行性与安全性进行考察。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

第四代聚酰胺胺聚合物（PAMAM G4，威海晨源分子新材料有限公司）；盐酸阿霉素（DOX·HCl，阿拉丁试剂有限公司）；无水乙醇、无水甲醇、三乙胺（国药集团化学试剂有限公司）；溴化噻唑蓝四氮唑（MTT，道赛尔生物科技有限公司）；胰酶、RMPI 1640培养基（Gibco，美国）；多肽pep（CPLGVRGC）通过标准固相合成法制备。小鼠乳腺癌细胞4T1购买于中科院典型培养物保藏委员会细胞库（上海）。

1.2 主要仪器

AE-31荧光倒置显微镜（Motic，德国）；FA1004N 电子分析天平（Sartoriu，德国）；高速冷冻离心机（Effendorf，德国）；MS-H-PRO 型恒温磁力搅拌器（上海麦淳光生物公司）；真空冷冻干燥机（Labconco，美国）；Zeta size ZS90型粒度测定仪（Malvern，英国）。

1.3 方 法

1.3.1 PAMAM/DOX的制备与表征 称取20 mg DOX·HCl溶解在甲醇溶液中，加入数滴三乙胺中和盐酸释放出游离的DOX。随后，调整DOX和PAMAM的摩尔比，将一定量的 PAMAM水溶液缓慢滴入甲醇中。避光搅拌24 h后，用去离子水（3.5 kDa）透析过夜。最终的纳米复合物通过冻干得到一件红色的产品［11］。通过透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察颗粒的形态与粒径，同时将颗粒溶解在新鲜的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）溶液中，使用激光粒度散射仪（dynamic light scattering，DLS）进一步检测其粒径与Zeta电位。检测不同比例下纳米复合物的载药率，通过核磁共振氢谱对化合物的结构进行表征。

1.3.2 PAMAM/DOX的载药率、包封率测定 称量10 mg DOX溶于10 mL甲醇溶剂中，配置得到1 mg/mL的DOX甲醇标准溶液，稀释至100 μg/mL。以甲醇为空白对照，对DOX标准液进行全波段扫描（200~800 nm），确定DOX标准品的最大吸收峰。配置不同浓度梯度的标准品溶液，在DOX的特征吸收波长下测定各浓度DOX溶液的吸光度，绘制DOX 标准样品的紫外光谱（ultraviolet spectrum，UV）标准曲线。采用紫外可见分管光度计对各纳米复合物在479 nm的吸光度进行检测，并计算其载药率与包封率。

1.3.3 PAMAM/DOX-pep的制备与表征 4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SMCC）被用来作为交联剂，通过MMP-2敏感的多肽pep交联PAMAM/DOX形成大粒径纳米颗粒PAMAM/DOX-pep［12］。首先，将SMCC溶解于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中至溶液浓度为10 mg/mL，与 PAMAM/DOX（10 mg/mL）的溶液按1∶5的摩尔比在磁力搅拌的过程中缓慢混合，室温搅拌30 min。随后，将多肽pep缓慢滴加到马来酰胺活化的 PAMAM/DOX中，4 ℃下搅拌过夜得到PAMAM/DOX-pep。最后，通过离心过滤装置超滤除去多余的小分子原料并冻干。使用1H核磁共振对产品进行分析；使用Nano-ZS90 Malvern仪器在25 ℃下测量平均粒径和Zeta电位，同时通过TEM观察纳米颗粒的形态和尺寸大小。

1.3.4 各纳米复合物的药物释放率 将2 mL PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep的PBS溶液（500 μg/mL）加入透析袋（3.5 kDa），浸没在pH值为5.0或7.4的PBS 溶液中，37 ℃下缓慢搅动透析。每隔4 h，收集释放的DOX并通过UV-Vis光谱分析来测量释放的DOX的浓度。将等体积的新鲜PBS补充到释放介质中，以保持溶液的体积不变。

1.3.5 PAMAM/DOX-pep的溶血率 取新鲜兔血5 mL，加入5 mL生理盐水反复洗涤、离心，直至上清略黄且无血色，弃去上清，取0.2 mL底物稀释至10 mL，得到2%的红细胞悬液。将PAMAM/DOX-pep溶于PBS溶液至浓度为10 mg/mL，稀释后得到一系列浓度梯度的纳米复合物溶液（10、20、50、100、200、500 μg/mL）。取等体积的纳米制剂与红细胞溶液共孵育，并设置阴性（PBS）和阳性（纯水）对照。37 ℃下孵育3 h后，通过离心（3 000 rpm，10 min）除去完整的红细胞。取上清液检测各处理组541 nm处的吸光度，通过以下公式进行计算以获得溶血率（HR%）：HR%=（At-Anc）/（Apc-Anc）×100，其中At、Anc和Apc分别是测试样品，阴性对照和阳性对照的吸光度值。

1.3.6 PAMAM/DOX-pep的体外稳定性 为了研究纳米集簇的稳定性，将PAMAM/DOX-pep置于含有10% 胎牛血清的PBS溶液中，并在4 ℃的黑暗环境下储存7天，每24 h取适量溶液稀释至1 mL，通过纳米粒度仪检测其粒径，以评价纳米颗粒的体外稳定性。

1.3.7 各纳米复合物的靶向性 当4T1细胞汇合度为80%~90%时，消化离心，收集细胞悬液接种于含有细胞爬片的24孔板内。孵育24 h后，弃培养基，将 Free DOX、PAMAM/DOX-pep、PAMAM/DOX-pep（MMP）分别溶解于无血清RMPI 1640培养基中并加入到24孔板中，孵育4 h。随后，弃培养基，用PBS温和洗涤3次，每孔加入预冷的300 μL 4 %多聚甲醛固定30 min。弃多聚甲醛，用PBS温和摇动润洗 5 次后，每孔加入200 μL DAPI（4，6-diamino-2-phenyl indole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚）孵育5 min对细胞核进行染色。PBS温和摇动润洗5次洗去多余的核染液后，取出细胞爬片，滴加5 μL防淬灭封片液后倒扣于载玻片上，在共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。取对数期细胞接种于12孔板中，以同样的方式处理细胞，收集并通过流式细胞仪定量分析细胞摄取情况。

1.3.8 各纳米复合物的体外抗肿瘤效果 离心收集4T1细胞细胞悬液接种于96孔板中（每孔1 000~2 000个细胞），37 ℃恒温培养24 h。将DOX、PAMAM/DOX、PAMAM/DOX-pep溶于完全培养基中，使DOX 的浓度分别达到0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、2.5 μg/mL和5 μg/mL，配置成不同浓度的纳米制剂。设置阳性对照组（仅添加细胞）和阴性对照组（仅添加培养基），每一组设置5个平行孔。在37 ℃和5% CO2培养24 h后，避光加入20 μg MTT（溶解于PBS，5 mg/mL）和80 μg无血清RMPI 1640培养基，避光孵育4 h。吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，低速震摇20 min后，用酶标仪在490 nm处检测吸光度并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（AX-A0）/（AC-A0）×100，其中AX为加药组的吸光度、AC为阳性对照组、A0为阴性对照组），采用Graphpad prism软件计算DOX的IC50（半抑制浓度）。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS 21. 0软件进行统计学分析，计量资料用表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PAMAM/DOX的表征、载药率与包封率

将DOX物理包埋于PAMAM的疏水空腔内部，形成PAMAM/DOX。通过紫外分光光度计进行检测，当DOX与PAMAM的摩尔比为30∶1时，纳米颗粒的载药率为23.53%，最适宜用做载药，选取这一比例下形成的PAMAM/DOX进行后续实验（表1）。TEM与粒度仪检测显示，纳米颗粒的尺寸约为10 nm（图1a）。TEM 结果显示（图1b），纳米颗粒呈圆形，其内部疏水空间清晰可见，分散性良好。

图1 PAMAM/DOX 的DLS 粒径（A）与TEM 图（B）

表1 不同比例PAMAM/DOX的粒径、电位与载药率

2.2 PAMAM/DOX-pep的表征

PAMAM表面包含大量氨基结构，易于化学修饰。本研究使用SMCC作为交联剂，将多肽pep中的半胱氨酸上的巯基与PAMAM上的氨基缀合，以获得大尺寸的纳米颗粒PAMAM/DOX-pep，1H NMR谱图见图2，PAMAM/DOX的特征峰δ分别为2.45、2.61、2.81、3.28 ppm，而δ = 8.5 ppm处形成的新峰代表多肽的成功连接。通过TEM观察纳米颗粒PAMAM/DOX-pep，其外观呈球状，表面小颗粒立体可见，粒径约为200 nm（图3A），与DLS检测一致（图3B），电位为-0.3 mV（图4）。粒径与Zeta电位的变化也印证了大粒径纳米颗粒的成功合成。

图2 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的核磁共振氢谱

图3 PAMAM/DOX-pep 的TEM 图（A）与DLS 粒径（B）

图4 PAMAM/DOX-pep 的电位

2.3 DOX的释放率

将PAMAM@DOX和PAMAM/DOX-pep分别置于pH为7.4和5.0下的 PBS透析液中，以考察化疗药物DOX释放效率。两种纳米颗粒在不同pH下均表现出一定的缓释能力，大粒径的PAMAM/DOX-pep最佳，小尺寸的PAMAM/DOX次之（图5）。当pH为7.4时，PAMAM/DOX、和PAMAM/DOX-pep的药物释放率分别为41%和33%；这说明由于多肽具有丰富的侧链功能化位点、多样的亲疏水性以及能够形成稳定的二级结构的能力，其修饰后有效延缓了药物的释放。当pH为5.0时，PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep的药物释放率分别为79%和68%。

图5 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的药物释放率

2.4 PAMAM/DOX-pep的溶血率

通过溶血实验研究PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep纳米颗粒的血液生物相容性。结果表明，纳米颗粒的溶血率存在一定剂量依赖性。随着纳米集簇浓度的增加，其溶血率也略有增加，其中，PAMAM/DOX-pep的溶血率略低于PAMAM/DOX，见图6。多肽修饰后PAMAM/DOX-pep溶血率在500 μg/mL下。溶血率仍小于5%，可能的原因是多肽修饰后的纳米颗粒正电位降低，从而降低了溶血率。

图6 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的溶血率（n=3）

2.5 PAMAM/DOX-pep的体外稳定性

通过马尔文粒度仪检测粒径来确定纳米颗粒的体外稳定性。总体来说，PAMAM/DOX-pep的粒径在7天内均无显著变化，较为稳定，见图7。而从第5天开始，PAMAM/DOX的粒径增加，发生团聚，而PAMAM/DOX-pep依旧保持稳定。

图7 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 体外7 天内的粒径变化（n=3）

2.6 肿瘤细胞对纳米颗粒的摄取行为

使用流式细胞术检测各纳米制剂的细胞摄取，结果见图8。相比于游离DOX，多肽交联后形成的大粒径纳米颗粒PAMAM/DOX-pep的细胞摄取量有所增加，但主要集中在细胞质中，与细胞核重叠度不高（图8B）。而PAMAM/DOX与MMP-2共孵育的PAMAM/DOX-pep细胞摄取量显著提高，可见小粒径纳米颗粒的细胞摄取优于大尺寸纳米颗粒。同时，酶分解后的纳米颗粒小摄取量高于小颗粒PAMAM/DOX，这可能是多肽的修饰改变了其表面电位基团，促进其入胞。通过共聚焦显微镜（CLSM）对各纳米制剂的细胞摄取情况进行直观的观察，结果与流式细胞术一致（图8a，c）。PAMAM/DOX-pep处理过的细胞药物荧光强度更高，摄取量更多。且Merge图中，DOX红色荧光与细胞核蓝色荧光相重叠，这说明尺寸可变纳米集簇有助于药物富集在肿瘤细胞核位置。

图8 各纳米制剂处理后4T1 细胞的药物摄取情况

图9 DOX、PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 对细胞的毒性（n=5）

2.7 PAMAM/DOX-pep的体外抗肿瘤效果

采用MTT法检测各纳米复合物的体外抗肿瘤效果，作用24 h后，各制剂对细胞均有一定程度的损伤，且呈剂量依赖性。DOX对4T1细胞的IC 50为0.62 μg/mL，相比于游离DOX，PAMAM包载后增加了DOX的细胞摄取量，从而增加了细胞毒性。

3 讨 论

本研究构建了肿瘤微环境响应型纳米递送系统PAMAM/DOX-pep，并对其理化性质，以及通过尺寸缩小克服体内生物学障碍实现靶向递送的可行性在小鼠乳腺癌细胞模型中进行研究。该纳米递送系统的初始尺寸为200 nm，适宜通过EPR效应在肿瘤部位蓄积；到达肿瘤部位后，多肽pep被肿瘤部位高表达的MMP-2裂解，PAMAM/DOX-pep分解为尺寸约为10 nm的PAMAM/DOX，实现靶向药物递送。由于肿瘤部位的 pH 低于正常组织，纳米颗粒酸性条件下的高药物释放率有助于肿瘤部位靶向药物释放，从而提高抗肿瘤作用。结果表明，大粒径纳米颗粒PAMAM/DOX-pep更有助于化疗药物DOX的缓释与低pH下的靶向释放。此外，多肽pep的修饰可以在一定程度改善纳米颗粒的体内稳定性，有助于维持纳米颗粒在体内的长循环，纳米颗粒在体外7天内较为稳定；在实验所需的特定浓度下可以忽略PAMAM/DOX-pep的溶血性能，该材料血液相容性良好，可以认为其安全低毒，适合用于静脉给药。体外模拟PAMAM/DOXpep被分解并探究其在4T1细胞摄取量的实验中，PAMAM/DOX-pep与MMP共孵育后细胞摄取量提高，靶向性增加。在对乳腺癌细胞的细胞毒性与抗肿瘤效果中，多肽pep修饰过的大粒径纳米颗粒细胞毒性略低于PAMAM/DOX，侧面印证了小粒径纳米颗粒的细胞摄取量较高，从而引发了更高的细胞毒性。这些结果为下一步的体内外抗肿瘤研究奠定基础，并为设计与构建新型药物递送系统实现高效低毒的精准靶向给药策略提供了方向和依据。