黄芪总皂苷对三氧化二砷诱导H9c2细胞损伤的保护作用

杨秀华 ，钱新宇，王玥璇，智慧，艾丹，肖云峰*

（1 内蒙古医科大学 药学院，呼和浩特 010110；2 呼伦贝尔职业技术学院，呼伦贝尔 021000；3 包头市第四医院，包头 014030）

三氧化二砷（ATO）俗称砒霜，最初被用于治疗银屑病或结核病的辅助药物［1-2］.随着医学的发展，发现其可用于治疗急性早幼粒细胞白血病［3］，治愈率高达80%以上［4］.随着对ATO的逐步研究，发现其对肺癌［5］、宫颈癌［6］、肝癌［7-8］等疾病也具有较好的治疗作用，应用前景良好.但在抗肿瘤时它对心、脑、肾等也会产生一定的毒性［9］.研究表明，ATO 通过引起氧化应激反应致使细胞损伤，最终导致细胞凋亡［10-11］，故抑制细胞凋亡可能是减轻ATO 诱导心脏毒性的合理方法之一.黄芪总皂苷（ASTs）是中药黄芪的成分之一，本课题组前期实验结果发现，ASTs可以激活PI3K/Akt/Nrf2 信号传导途径而发挥抗氧化作用［12］，但是它能否最终抑制细胞凋亡，是本文的研究重点.现有研究显示：ASTs 通过明显降低Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白表达及促进Bcl-2 表达来发挥对过氧化物诱导心肌细胞凋亡的作用［13-14］.因此，本文拟通过观察ASTs 对ATO 诱导的H9c2 细胞形态、凋亡率及凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9mRNA 和蛋白表达的影响，探讨ASTs对ATO所产生的心肌细胞毒性的保护作用，为ASTs进一步的研究和应用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与细胞

H9c2心肌细胞（上海富恒细胞库）；黄芪总皂苷（南京狄尔格医药科技）；Bax 抗体、Bcl-2 抗体、Caspase-9抗体、β-actin抗体（英国abcam）；Caspase-3抗体（美国CST）；合成引物（上海生工）.

1.1.2 主要仪器

台式高速冷冻离心机（3K15，美国Gene Company Limited）；荧光倒置生物显微镜（DM3000，德国Leica）；CO2培养箱（MCO-15AC，美国Thermo Fisher）；立式高压蒸汽灭菌锅（ES-315，日本TOMY）；电泳仪（Mini Trans-Blot，美国Bio-Rad）；红外荧光扫描成像系统（ODYSSEY CLX，美国LI-COP）.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将H9c2 细胞接种于含10%FBS 的DMEM 培养基中进行培养.当细胞生长融合至约80%时，用0.25%胰酶消化传代，取对数生长期的细胞用于后续实验.

1.2.2 检测ATO对细胞活力的影响

将细胞密度调为1×104个/孔，接种于96 孔板，孵育36 h.空白组用无血清培基液处理，ATO 组分别用含有终浓度为1、2、4、6、8、10 µg·mL-1ATO 无血清培养12 h.取10 µL 的CCK-8 液添加至每孔中，孵育1 h，测定波长为450 nm的吸光度，计算细胞存活率.

1.2.3 检测ASTs对细胞活力的影响

细胞分组前操作同1.2.2.空白组用无血清培养液处理，ASTs 预孵育组将含有终浓度为25、50、100 µg·mL-1ASTs 的无血清培养液作用12 h，换液，继续培养12 h，计算存活率.

1.2.4 检测ASTs对ATO致H9c2细胞的损伤的影响

细胞分组前操作同1.2.2.空白组无血清孵育12 h 后，换液，继续培养12 h；模型组用培养基孵育12 h 后换用6 µg·mL-1ATO 的培养基孵育12 h；ASTs（低、中、高）浓度组分别加入25、50、100 µg·mL-1含ASTs的培养基孵育12 h后换用6 µg·mL-1ATO 的培养基孵育12 h.监测其生长状态，计算各组细胞存活率.

1.2.5 Hoechst 33342染色观察H9c2细胞凋亡形态

将细胞密度调为1×105个/孔，接种于24 孔板，孵育36 h.分组及培养时间同1.2.4.后续实验按说明书进行，观察细胞凋亡形态并进行拍照.

1.2.6 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率

将细胞密度调为2×106个/孔，接种于6 孔板，孵育36 h.分组及培养时间同1.2.4，0.25%胰酶消化细胞，离心收集，后续实验严格按照说明书进行操作，1 h内用流式细胞仪检测凋亡率.

1.2.7 RT-qPCR测定相关mRNA表达水平

将细胞以1×106个/孔接种于6 孔板中，孵育36 h.分组及培养时间同1.2.4，后续实验严格按照说明书进行操作，用RT-qPCR 技术检测相关凋亡因子mRNA的表达.引物序列见表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.8 Western Blot检测相关蛋白表达

将心肌细胞以1×106个/孔接种于6 孔孵育板中，孵育36 h.分组及培养时间同1.2.4，收集细胞，提蛋白，测定蛋白浓度.后续实验严格按照说明书进行操作，使用红外激光成像系统检测相关凋亡因子蛋白表达水平.

1.2.9 统计学方法

2 结果

2.1 ATO对心肌细胞活力的影响

用CCK-8 法检测并计算不同浓度ATO 对H9c2细胞的存活率，结果见图1.由图1可知：与空白组比较，ATO 1～10 µg·mL-1组细胞活力显著降低（P＜0.01）.

图1 ATO对心肌细胞存活率的影响（n=6）Fig.1 Effect of ATO on the survival rate of cardiomyocytes（n=6）

2.2 ASTs对心肌细胞活力的影响

用CCK-8 法检测并计算不同浓度ASTs 对H9c2细胞的存活率，结果见图2.由图2 可知：与空白组比较，ASTs 各浓度组对H9c2 细胞存活率无明显影响（P＞0.05），不会干扰对ATO 诱导细胞凋亡影响的实验结果.

图2 不同浓度ASTs对H9c2细胞存活率的影响（n=6）Fig.2 Effects of different concentrations of ASTs on the survival rate of H9c2 cells（n=6）

2.3 ASTs 预孵育对ATO 致H9c2 细胞活力下降的影响

CCK-8 法检测并计算各组别细胞的活力，结果见图3.由图3可知：与空白组比较，模型组细胞活力显著降低（P＜0.01）.与模型组比较，ASTs 25、50、100µg·mL-1预孵育12 h可显著提高细胞活力（P＜0.01），以高浓度组保护作用最佳.

图3 ASTs对ATO诱导心肌损伤的保护作用（n=6）Fig.3 Protective effect of ASTs on ATO-induced myocardial injury（n=6）

2.4 ASTs 预孵育对ATO 致H9c2 细胞损伤形态学影响

各组细胞处理后，观察其生长状态及形态学变化，结果见图4.由图4 可知：空白组H9c2 心肌细胞生长状态好、数量多、均呈长梭形；模型组细胞收缩成圆形，伴有大量细胞死亡；ASTs 各浓度组大部分细胞仍保持长梭形形态，以高浓度组细胞形态最佳.

图4 ASTs对ATO诱导的H9c2细胞损伤的形态学影响Fig.4 Morphological effects of ASTs on ATO-induced injury in H9c2 cells

2.5 ASTs对H9c2细胞凋亡形态的影响

细胞处理后，观察H9c2 细胞凋亡形态，结果见图5.由图5可知：空白组细胞荧光染色均匀，呈低蓝色，形态大小均一，很少见凋亡细胞［图5（a）］；模型组呈亮蓝色，可见核固缩，凋亡细胞增多［图5（b）］；与ATO模型组比较，ASTs低、中、高浓度组凋亡细胞比例显著减少，正常细胞数目增多［图5（c）-图5（e）］.

图5 ASTs对H9c2细胞凋亡形态的影响（10×10）Fig.5 Effects of ASTs on the apoptosis morphology of H9c2 cells（10×10）

2.6 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率

将各组细胞处理后，流式细胞仪检测凋亡率，结果见图6.由图6可知；与空白组相比，模型组细胞凋亡细胞显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，ASTs 各组凋亡细胞显著减少（P＜0.01）.

图6 流式细胞术检测H9c2细胞凋亡率（n=3）Fig.6 H9c2 cell apoptosis rate detected by flow cytometry（n=3）

2.7 ASTs预孵育对相关mRNA表达水平的影响

将各组细胞处理后，用RT-qPCR 技术检测相关mRNA表达水平，结果见图7.由图7可知：与空白组比较，ATO 降低了Bcl-2mRNA 水平（P＜0.01），升高了Bax、Caspase-3、Caspase-9mRNA 水平（P＜0.01）；与模型组比较，ASTs升高了Bcl-2mRNA水平（P＜0.01），降低了BaxmRNA 水平（P＜0.05），ASTs中、高浓度组降低了Caspase-3、Caspase-9mRNA水平（P＜0.05）.

图7 ASTs对心肌细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达的影响（n=3）Fig.7 Effect of ASTs on the expression of Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9 mRNA in cardiomyocytes（n=3）

2.8 ASTs预孵育对相关蛋白表达的影响

将各组细胞处理后，用红外激光成像系统检测各组细胞的相关蛋白的表达，结果见图8.由图8 可知：与空白组比较，ATO降低Bcl-2/Bax水平（P＜0.01），升高Caspase-3、Caspase-9 水平（P＜0.01）；与模型组比较，ASTs中、高浓度升高Bcl-2/Bax水平（P＜0.01），降低Caspase-3、Caspase-9水平（P＜0.05）.

图8 ASTs对H9c2细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达的影响（n=3）Fig.8 Effects of ASTs on the expression of Bax，Bcl-2，Caspase-3 and Caspase-9 proteins in cardiomyocytes（n=3）

3 讨论

ATO 发挥抗恶性肿瘤作用的主要机制是其能够诱导肿瘤细胞凋亡，但同时也是产生毒性反应的主要原因之一［15］.本文发现：ATO 导致H9c2 心肌细胞活力下降，心肌细胞凋亡发生率显著升高，心肌细胞凋亡数目增多，这是药物产生心脏毒性的重要病理机制之一，因此抑制心肌细胞凋亡是考察心脏保护药物药效的指标之一.ASTs 预孵育能提高心肌细胞活力，降低细胞凋亡的比例，从而降低 ATO 产生的心脏毒性，发挥心脏保护作用.

细胞凋亡是维持各器官、组织及细胞等所处内环境稳态的重要方式［16］，是一种复杂的分子调控机制，由Bcl-2 家族和Caspase 家族两大家族进行调控.Bcl-2 家族是主要的细胞调控基因之一，作用于线粒体，使膜通道开放以及促凋亡物质流动［17］，是调节细胞凋亡过程的一类蛋白质，由抗凋亡因子和凋亡因子组成.其中Bcl-2 是抗凋亡因子，保护细胞免于凋亡，Bax 是促凋亡因子，促使细胞凋亡，二者共同决定细胞的存亡［18-19］，Bcl-2与Bax是一对最主要的拮抗基因，Bcl-2与Bax可形成异二聚体，其比值参与细胞凋亡的调控［6］.李珊珊等［20］研究发现：华蟾素通过上调Bax，下调Bcl-2基因而诱导人胃癌 MKN-45 细胞凋亡.本文研究发现：ASTs 使Bcl-2/Bax 明显升高，显示其抗凋亡作用，抑制ATO 引起的心肌细胞凋亡.Caspase家族相关因子在细胞凋亡中也发挥了至关重要的作用，主要是诱导细胞程序性死亡而介导细胞凋亡［21］.其中 Caspase-9、Caspase-3是介导细胞凋亡的关键因子.Caspase-9 是内源性凋亡通路的关键酶，Caspase-3是死亡因子，可激活凋亡信号的传递，是最为关键的凋亡执行者，其过表达可加速细胞凋亡进程［22］.当Caspase-9 被启动后，Caspase-3 表达增加，可通过裂解蛋白激酶及细胞骨架而导致细胞凋亡.程婷婷等［23］研究发现地参多糖通过下调Caspase-3、Caspase-9基因表达而发挥对非小细胞肺癌 A549 细胞的凋亡作用.本文研究发现：ASTs 使Caspase-3、Caspase-9水平显著下降，减少细胞凋亡.

综上所述，本文结果提示：ASTs 对ATO 诱导的H9c2 细胞凋亡具有保护作用，可能与调控Bcl-2/Bax、Caspase-3、Caspase-9 凋亡相关因子有关，但其抑制凋亡的更多机制有待于进一步研究.