鲜姜采后禾谷镰刀菌侵染过程中挥发性风味物质的变化

孟秀玲，牛 犇，郜海燕，刘瑞玲，陈慧芝，吴伟杰,*，陈杭君,*

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，农业农村部果品采后处理重点实验室，农业农村部蔬菜采后保鲜与加工重点实验室（部省共建），浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江 杭州 310021）

生姜（Zingiber officinaleRosc.）属于姜科（Zingiberaceae）姜属（Zingiber）多年生草本根茎类作物，在药用和食品两方面具有应用范围广、可深加工等特性。目前在亚洲、非洲以及澳大利亚等地区都有种植栽培[1]。生姜可以活血逐瘀、解表散寒，温中止呕，抗菌消炎，促进血液循环、减少动脉粥样硬化，降低血糖、血脂和血压[2]。近年来，“中医药热”兴起并遍及世界，药材出口增多，世界各地对生姜的需求量急剧升高。

生姜采后贮藏期易受病原微生物侵染，造成品质劣变。目前关于生姜病原微生物的研究多以采前病原菌为主，李明通[3]从山东潍坊种植期发生根腐病的生姜中分离鉴定出了群结腐霉（Pythium myriotylum），陈旭玉等[4]从具有叶枯病的高良姜发病部位分离出了可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）以及研究报道从发生青枯病的生姜中分离出青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）[5]，但针对生姜采后贮藏期病原菌研究较少。目前，不同产地的生姜在采后贮藏期均存在不同程度的病害问题。明确生姜采后贮藏期主要致病菌对针对性地制定采后病害防控技术、维持贮藏期生姜品质具有十分重要的意义。风味是影响果蔬品质的重要因素，目前对生姜挥发性风味物质的研究大多集中在不同成熟度生姜及采后处理过程中风味物质的测定[6-11]，对生姜在采后贮藏期病害发生过程中挥发性物质的变化规律以及特征性风味物质的变化研究还鲜有报道。本实验以浙江江山产区采后贮藏期的病害生姜为研究对象，旨在探究明确其采后贮藏期主要致病菌以及病害发生过程中生姜挥发性风味物质的变化，以期为其采后病害防控技术的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采后贮藏期发生病害的生姜样本来自于浙江江山产区。将样品带到浙江省农业科学院食品科学研究所食品物流保鲜与品质调控团队实验室进行病原菌分离鉴定。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）、马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose broth，PDB）北京酷来博科技有限公司；正癸烷（纯度99.9%）上海阿拉丁试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MLS-3781L-PC型高压蒸汽灭菌器 日本松下健康医疗器械有限公司；MJX-160B-Z型霉菌培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；无菌超净工作台 江苏苏净集团有限公司；气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）仪 上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分离纯化及回接验证

根据《植病研究方法》[12]，用无菌手术刀在病健交界处切取小块生姜组织，消毒后转入PDA培养基平板中25 ℃、相对湿度85%～90%的条件下进行培养，待菌落长出后，不断重复分离纯化的操作，直到产生单一菌落。依据Koch法则，采用有伤接种的方法将分离出的菌丝回接至健康生姜，发病后对病原菌再次鉴定，判断与分离前是否一致。

1.3.2 病原菌形态学鉴定

菌株：从发病生姜中分离鉴定获得的菌株，从-4 ℃斜面转至PDA平板上活化两次备用。

孢子悬浮液制备：称取150 g绿豆加入250 mL蒸馏水，绿豆煮沸至糊状，经纱布过滤得滤液，冷却至室温存放备用。挑取培养于PDA平板4～5 d的菌丝若干于制备好的绿豆液体培养基中，25 ℃、150 r/min振荡培育9 d，收集孢子悬浮液[13]。利用血细胞计数板调整孢子悬浮液的浓度至1×106CFU/mL，-4 ℃暂存备用[14]。挑取活化后的菌丝以及培育的孢子分别制片，于光学显微镜下观察菌丝和孢子形态。

1.3.3 病原菌分子生物学鉴定

1.3.31 提取致病菌DNA基因组

取25 ℃、相对湿度85%～90%恒温培养3～4 d的菌丝转移至PDB，25 ℃、150 r/min培养3 d，收集菌丝体，洗涤滤干备用，采用CTAB法[15]提取致病菌DNA。

1.3.32 病原菌rDNA-ITS序列扩增

采用真菌通用引物ITS1和ITS4对提取的基因组DNA进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR ）扩增[16]。引物序列为：ITS1 ：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGC-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR扩增反应体系（50 μL）：金牌Mix（green）45 μL、ITS1（10 μmol/L）2 μL、ITS4（10 μmol/L）2 μL、模板DNA 1 μL。体系配好后，置于PCR仪上进行扩增。扩增程序：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35 个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃条件保存。配制1.2%的琼脂糖凝胶，进行电泳检测、染色、回收DNA片段。引物合成和DNA测序均委托杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。

1.3.33 病原菌16S rDNA序列分析及进化树构建

已知序列后，将其上传至NCBI网站进行BLAST在线比对，利用GenBank数据库寻找相似度较高的序列来初步判断目标菌的种属。通过大样本筛选选出真正具备高度同源性的核苷酸序列，选用Neighbor-Joining[17]方法用MEGA7构建目标菌的系统进化树，结合目标菌的生物学形态以及PCR扩增的电泳结果最终确定菌株种属。

1.3.4 鲜姜挥发性风味物质的测定

生姜中挥发性物质的萃取操作参考汪莉莎等[18]方法，略作修改。将生姜用液氮研磨成粉末状，称取1 g生姜样品置于20 mL固相微萃取瓶中，加入10 μL正癸烷（1 μg/mL）作为内标物，密封萃取瓶，将50/30 μm萃取头插入萃取瓶中，于50 ℃水浴条件下顶空吸附0.5 h。

GC条件：色谱柱：DB-5MS 石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：先以50 ℃保持1.5 min，以8 ℃/min升温至123 ℃，然后再以3 ℃/min升到144 ℃，再以0.5 ℃/min升至148 ℃，最后以15 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；进样口温度为250 ℃；载气He；流速1.0 mL/min；压力53.6 kPa；进样量0.6 μL；分流进样；分流比：50∶1。

MS条件：检测器电压830 eV；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃；数据采集方式Scan；扫描速率769 u/s；质量扫描范围m/z40～400 。

以面积归一化法计算相对含量；绝对含量（以正癸烷计算）按下式进行计算：

式中：ρ为内标物质量浓度/（μg/mL）；V为内标溶液体积/mL；S1为各挥发性组分峰面积；S为内标物峰面积；m为样品质量/g。

1.4 数据统计与分析

所有数据均采用Origin 2021进行绘图。通过软件SPASS 24.0 Duncan检验对实验中挥发性风味物质的含量进行数据统计与差异显著性分析，当P＜0.05时，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离纯化及致病性验证

按照组织分离法，从发生病害的生姜上一共分离出了4 种病原菌，分别编号为RS-1、RS-2、RS-3、RS-4（图1）。依据Koch法则，采用针刺法将4 种病原菌分别回接到健康生姜上进行验证，发现只有病原菌RS-1能导致生姜发病，且产生的病症与自然发生病害的生姜病症一致（图2A），病症为产生丝状的白毛（图2C），发病位置变软，致使生姜腐烂。在腐烂位置分离到与第1次分离相同的菌株，符合Koch法则。表明该菌为生姜采后主要致病菌。

图2 生姜贮藏期间自然发病症状（A）、健康生姜（B）、回接发病症状（C）、菌落特征（D）、菌丝形态图（E）以及孢子形态图（F）Fig.2 Natural symptoms (A),healthy ginger (B),back inoculation-caused symptoms (C),colony characteristics (D),mycelium morphology (E) and spore morphology (F) during ginger storage

由图1A可知，RS-1生长初期菌落形态呈白色丝状真菌，菌丝生长速度较快。菌落成熟后形态如图2D所示，菌落中心变为粉色，颜色逐渐向四周扩散，菌落背面带有深粉色。RS-1菌丝形态如图2E所示，菌丝长而细，内里有隔呈竹节状。孢子形态如图2F所示，孢子有约3～4 个隔膜，两端弯曲尖锐，中间圆润饱满，呈镰刀形状。初步鉴定病原菌RS-1为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）。

2.2 病原菌rDNA-ITS序列和系统发育树分析

由图3A可知，在750 bp处产生明显的单一条带。此扩增得到的核苷酸序列在NCBI网站上经过对比与禾谷镰刀菌（F.graminearum）具有较高的同源性。大样本筛选后最终选取11 株同源性较高的菌株用MEGA7软件进行多序列比对构建系统发育树（图3B），由系统发育树可知，RS-1菌株与禾谷镰刀菌（OQ438102.1F.graminearum）聚为一支，亲缘关系较近。结合菌落形态、生物学特征、序列比对以及发育树的构建最终确定浙江江山产区生姜采后贮藏期主要致病菌为禾谷镰刀菌（F.graminearum）。

图3 生姜采后分离病原菌rDNA-ITS区PCR扩增产物的电泳结果（A）和基于ITS基因序列构建的RS-1系统发育树（B）Fig.3 Eelectrophoretograms of PCR products of rDNA-ITS (A) and phylogenetic tree based on ITS sequences of strain RS-1 from ginger (B)

2.3 鲜姜不同部位挥发性风味物质的测定

健康组织、病健交界处组织和发病组织GC-MS图见图4，具体成分结果见表1。由表1可知，从鲜姜的不同部位共鉴定出58 种挥发性风味物质，主要包括烃类、醇类、酯类、醛类、酮类五大类，化合物数量见图5A，其中健康组织中一共鉴定出40 种挥发性风味物质，其中含有烃类18 种、醇类7 种、酯类5 种、醛类6 种以及酮类4 种；病健交界处组织一共鉴定出35 种挥发性风味物质，其中烃类16 种，醇类7 种、酯类4 种、醛类5 种、酮类3 种；发病组织中一共鉴定出39 种挥发性风味物质，烃类17 种、醇类10 种、酯类3 种、醛类6 种、酮类3 种。由测定结果可知，鲜姜中挥发性风味化合物数量最多的为烃类，占全部风味化合物80%以上。曲清莉等[19]利用GC-MS从姜粉中检测到56 种挥发性风味物质，其中烃类30 种，占全部挥发性风味物质的65%。汪莉莎等[18]研究仔姜与老姜挥发性风味物质的区别，从仔姜和老姜中分别检测到风味物质各63、68 种，其中烃类物质分别有37、45 种。王强伟等[20]研究鲜姜挥发性风味物质，从鲜姜中鉴定出51 种挥发性风味物质，其中烃类高达28 种，占总挥发性物质种类约55%，与本研究结果一致。

表1 不同部位鲜姜挥发性风味物质成分对比Table 1 Comparison of volatile flavor components in different parts of fresh ginger

图4 健康组织（A）、病健交界处组织（B）和发病组织（C）中挥发性成分GC-MS图Fig.4 GC-MS of volatile components in healthy tissues (A),junction between diseased and healthy tissues (B) and diseased tissues (C)

在禾谷镰刀菌侵染鲜姜过程中，不同部位检测到的共同挥发性风味物质共计21 种。其中烃类物质9 种，分别为α-蒎烯、莰烯、桧烯、萜品油烯、δ-榄香烯、(＋)-7-表-倍半萜烯、反式-β-金合欢烯、姜烯和β-倍半水芹烯；醇类物质5 种，芳樟醇和马鞭草烯醇、α-松油醇、香茅醇、反式-橙花叔醇；酯类物质2 种，乙酸香茅酯和乙酸香叶酯；醛类物质3 种，反式-2-癸烯醛、7-甲基-3-亚甲基-6-辛烯醛和香茅醛；酮类物质2 种，2-莰酮和甲基壬基甲酮。

其中，病健交界处组织较健康组织中新检出β-蒎烯、侧柏烯、(-)-α-荜澄茄油烯、2-茨醇、乙酸2-壬酯、乙酸橙花酯、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛以及2-庚酮8 种风味物质。发病组织处较健康组织新检出β-蒎烯、α-松油烯、A-香柠檬烯、顺式-α-佛柑油烯、(＋)-β-柏木萜烯、顺式-马鞭烯醇、4-萜烯醇、(＋)-γ-桉叶醇、乙酸2-壬酯、(E)-2-辛烯醛、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛以及(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛12 种风味物质。表明鲜姜受病原菌侵染过程中会诱导其产生与健康组织不同的挥发性风味物质，主要为烃类、醇类与醛类物质。

由表1和图5B可知，鲜姜健康组织中挥发性风味物质含量为烃类＞醛类＞醇类＞酯类＞酮类，分别占其总风味物质含量85.37%、6.90%、3.86%、3.58%和0.28%；绝对含量分别为6.19、0.50、0.28、0.26 µg/g和0.02 µg/g。病健交界处组织中挥发性风味物质含量为烃类＞醛类＞酯类＞醇类＞酮类，分别占其总风味物质含量84.57%、9.81%、3.52%、1.52%、0.57%；绝对含量分别为8.88、1.03、0.37、0.16、0.06 µg/g。发病组织的挥发性风味物质含量为烃类＞醛类＞醇类＞酯类＞酮类，分别占其总风味物质含量89.94%、4.56%、3.12%、2.12%、0.25%，绝对含量分别为14.40、0.73、0.50、0.34、0.04 µg/g。

由图5B可知，挥发性风味物质绝对含量方面，鲜姜发病组织＞病健交界处组织＞健康组织。病健交界处组织与发病组织绝对含量分别是健康组织的1.45 倍和2.21 倍。烃类化合物绝对含量在禾谷镰刀菌侵染鲜姜过程中显著升高（P＜0.05），分别为健康组织的1.43 倍和2.33 倍。其中倍半萜烯组分姜烯、β-倍半水芹烯均在3 个不同部位中检出且绝对含量持续升高，较健康组织中分别增加了51.2%和64.3%。醇类、酯类、醛类以及酮类化合物的含量变化较小。已有研究表明，病原菌的侵染能够导致单萜烯类挥发性组分大量释放[21]，当果实受到微生物侵染或者外界环境发生改变时，其生理状况往往会发生改变。

主成分分析（principal component analysis，PCA）通过对多指标进行降维的方法，综合评价果蔬风味品质的变化与比较，在果蔬中已广泛应用[22-23]。由图6A可知，PC1贡献率为78.4%，PC2贡献率为18.0%，总贡献率高达96.4%，表明PC1和PC2能够代表不同部位鲜姜挥发性风味物质的大部分信息，可以用来区分鲜姜健康组织、病健交界处组织和发病组织的挥发性风味。从PCA图可以看出，从不同部位检测到的挥发性风味物质完全没有重叠，表明禾谷镰刀菌侵染鲜姜过程中风味物质的变化存在较大差异，发生了显著的改变。其中健康组织与病健交界处组织在PC1距离更近，发病组织与健康组织在PC1上距离更远，而PC1代表了78.4%的样品信息，表明风味物质变化的差异随禾谷镰刀菌侵染的程度显现出更明显的区别。

图6 鲜姜不同部位挥发性风味物质PCA图（A）、VIP得分图（B）和热图（C）Fig.6 PCA plot (A),VIP score plot (B) and heatmap (C) of volatile flavor substances in different parts of fresh ginger

从VIP得分图和热图（图6B、C）可以看出，在病害发生过程中姜烯、β-水芹烯、桧烯、反式-2-癸烯醛、β-倍半水芹烯、(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯、莰烯、橙花醛得分较高，表明这些化合物为鲜姜病原菌侵染过程中挥发性风味的主要特征物质。

由表2可知，在健康组织中主要风味特征物质为莰烯、桧烯、β-水芹烯、姜烯、β-倍半水芹烯、反式-2-癸烯醛以及橙花醛；病健交界处组织中主要风味特征物质为莰烯、桧烯、姜烯、β-倍半水芹烯、反式-2-癸烯醛以及(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛；发病组织主要风味特征物质为莰烯、桧烯、β-水芹烯、姜烯、β-倍半水芹烯、反式-2-癸烯醛以及(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛等物质。其中，发病组织特征风味物质与健康组织相比，新检出(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛，未检出橙花醛；特征风味物质含量较健康组织均呈现增加，表明发病生姜风味的改变可能是由于病原菌侵染后风味物质的含量和种类发生变化所引起。

表2 不同部位鲜姜挥发性成分主要特征物质Table 2 Major characteristic volatile components in different parts of fresh ginger

3 讨论

鲜姜由于营养丰富在贮藏期易受到病原微生物侵染而导致品质出现下降。据多项研究报道，生姜采后病害主要由毕氏菌（Pythiumspp.）[24]、镰刀菌（Fusariumspp.）、被孢霉属（Mortierella）等引起[25]。刘继等[26]从四川莱芜大姜采后病害中鉴定出了黄色镰刀菌（F.culmorum）与被孢霉。张莞苓等[27]从山东省潍坊市的腐烂生姜中分离鉴定出了引起块茎腐烂的重要病原菌短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）两种细菌以及真菌尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。潘汝浩等[28]从山东带有枯萎病病症的生姜样本中分离鉴定出尖孢镰刀菌。这可能是由于鲜姜的品种以及地区的不同而导致。本研究针对浙江江山地区种植的鲜姜在采后贮藏期腐烂等问题进行研究，从采后贮藏期发生病害的鲜姜中分离鉴定得到主要致病菌株禾谷镰刀菌（F.graminearum）。

挥发性风味物质是果实的次级代谢产物。史先振等[9]研究铜陵白姜的主要风味物质为萜烯类，其中姜烯、β-倍半水芹烯、γ-姜黄烯和β-甜没药烯4 种组分占到了全部挥发性物质的50%以上，决定了铜陵白姜的典型风味。黄雪松等[10]以广东鲜姜为试样，检测出单萜和倍半萜类组分姜烯、水芹烯和金合欢烯相对含量均在9%以上，决定了广东鲜姜的主要风味。本实验从浙江鲜姜健康组织中共鉴定出38 种风味化合物、7 种主要特征物质，其中挥发性组分含量较高的姜烯、β-水芹烯和β-倍半水芹烯占到全部挥发性组分的68.7%，构成了浙江鲜姜的特殊风味。

近年来，大量研究认为果蔬挥发性风味物质的释放与其自身的抗病防御机制相关，认为病原菌侵染能够造成挥发性组分大量释放，且能够诱导其产生与健康果蔬不同的挥发性物质[29]。有研究表明单萜类化合物大多具有抵抗病原菌的作用[30-31]，在遭受病原菌侵害时会大量释放。唐会周[32]研究柑橘贮藏病害过程中挥发性风味物质变化发现，接种青霉菌后的柑橘单萜类化合物含量比不接菌组含量要高。陈沁媛[33]研究5 个不同品种柑橘病害前后风味变化发现，健康果肉组织中萜烃类相对含量占85%，损伤果肉组织中萜烃类相对含量增加到95%。Duccio[34]和Caccioni[35]等研究表明果蔬释放的挥发性物质能够在其贮藏期起到抑制病原菌的作用，且抑制效果与单萜烯类和倍半萜含量呈正比。本研究通过GC-MS检测鲜姜在受到禾谷镰刀菌侵染过程中挥发性风味物质的变化，研究发现鲜姜受到病原菌侵染过程中释放出与健康组织不同的挥发性组分，这些物质主要为烃类、醇类和醛类物质。发病组织的主要特征风味物质较健康组织新检出(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛，且烃类风味化合物和主要特征风味化合物的含量随病原菌侵染显著上升（P＜0.05），其中倍半萜烯组分姜烯和β-倍半水芹烯在鲜姜不同部位均被检测出且较健康组织分别增加了51.2%和64.3%，这可以表明鲜姜在感染禾谷镰刀菌后产生了应激效应，激发了自身抗病机制，从而导致倍半萜烯类物质的释放[36]，可以作为鲜姜遭受病害的判定指标。

4 结论

本研究从浙江江山产地鲜姜采后贮藏期病害部位分离鉴定出了禾谷镰刀菌。通过GC-MS检测鲜姜采后禾谷镰刀菌侵染过程中挥发性风味物质的变化，结果表明病害发生过程中烃类风味化合物含量显著增加（P＜0.05），其中倍半萜烯组分姜烯、β-倍半水芹烯大量释放。为后续针对性制定鲜姜采后病害防控技术提供理论基础，挥发性风味物质的差异变化可以为生姜感染该种病害的检测提供参考。