贵州六盘水地区大叶黄杨叶枯病病原菌鉴定

王瑞仙，田 霜，鲁武锋，方英艺，张孝敬，安传相，谭 莉，杨友联

1.凤冈县农业农村局，贵州凤冈 564200；2.六盘水师范学院 生物科学与技术学院，贵州六盘水 553004

大叶黄杨（Euonymus japonicusThumb）具有一定的观赏价值和生态价值，是园林绿化中的常见植物。由于其叶部病虫害发生普遍，常造成植株死亡，影响了其在园林绿化中的应用价值。目前，对大叶黄杨白粉病、大叶黄杨褐斑病（叶斑病）和大叶黄杨炭疽病的研究较为深入，病原菌分别为正木粉孢霉（Oidium euonymi-japonicaeSacc）、坏损尾孢（Cercospora destructiveRav）、胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz）[1-2]。但还没有对大叶黄杨叶枯病病害系统、全面的研究报道。李庚花等[3]研究发现大叶黄杨叶枯病的病原菌为半知菌亚门盘多毛孢属，而贲海燕[4]发现引起大叶黄杨叶枯病的病原菌为黄杨叶点霉，但该病原菌的形态结构与李庚花等报道的差别较大。上述研究均只采用了形态学鉴定的方法，且研究结果存在争议。因此，采用新技术手段进一步探索大叶黄杨叶枯病的病原菌，明确大叶黄杨叶部病害种类及其防控策略尤为重要。

研究发现，应用分子生物学技术可更加准确地鉴定病原菌种类，其中因核糖体转录间隔区序列（ITS）在众多基因序列中最容易被扩增及测序，已广泛应用于病原真菌检测[5]。但ITS序列拷贝引物位点高度保守，许多复合种不能单一地依靠ITS序列进行区分，且基因片段较短，在真菌系统学研究中存在不足[6]。除ITS外，甘油醛三磷酸脱氢酶基因（GPDH），α、β、γ-微管蛋白基因，钙调蛋白基因（CAL）等也被广泛应用于真菌系统学研究[7]。应用多基因分析结合形态学特征可提高真菌的准确识别率，使依靠形态学及单基因分析极难识别的复合种的鉴定成为可能。

近年来，在贵州省六盘水地区发现疑似大叶黄杨叶枯病的症状，发病后其叶片病斑呈圆形、多角形或不规则形，后期病斑上有丝状斑纹，叶面着生黑色分生孢子盘。该病害多危害叶片、嫩梢和幼茎，最终可致使叶片枯死掉落，严重时导致全株枯死。该病害存在大范围流行的趋势，严重影响了大叶黄杨的观赏及生态价值。为明确引起该病害的病原菌，采用形态学与多基因系统学相结合的方法，对贵州省六盘水地区疑似大叶黄杨叶枯病的病原菌开展研究，旨在确定其分类地位，为该病原真菌的防治奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

在贵州省六盘水市市区及水城县森林公园采集具典型特征的大叶黄杨叶枯病病害样品，对病斑进行拍照，装入牛皮纸信封中。将标本带回实验室进行分离纯化。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离纯化 采用稀释涂布法分离病原菌，将采集病叶样品进行纯化培养后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 病原菌形态学鉴定 将分离得到的2个菌株分别接种在PDA平板上，25 ℃恒温培养倒置培养7 d左右，采用十字交叉法测量菌落直径，观察菌落特征。分别刮取病害标本、PDA培养基上的分生孢子堆制成临时装片，采用奥林巴斯BX51显微摄像系统观察并拍摄分生孢子形态特征，并采用Spot32 v4.0.8软件测量其大小。

1.2.3 分离菌株的致病性鉴定 参照牛小瑞[8]和杨友联[9]等的方法，以浓度为3.0×106个孢子/mL的孢子悬浮液为接种体，分别对供试的2个菌株设室内创伤（针刺法）接种和无创伤接种2个处理，用无菌水接种作空白对照。于26 ℃恒温培养箱中保湿（70%以上）培养。每天观察记录发病情况。叶片发病后，从病健交界处分离菌株，完成柯赫氏法则验证。

1.2.4 多基因联合鉴定 分别将2个菌株接种于PDA平板上，25 ℃恒温培养7 d后刮取菌丝，采用改良的CTAB法提取菌株DNA[10]。选择核糖体转录间隔区序列（ITS）、β-微管蛋白（β-tubulin）和翻译延长因子1α亚基基因（tef-1）3个基因片段作为目标基因进行扩增与测序（表1）。ITS序列引物为ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），β-tubulin序列引物为BT2ATCTT），每个反应体系包括12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix酶，上、下游引物各1 μL，1.5 μL DNA模板和9 μL水，总体积为25 μL。按表2的扩增程序对3个基因片段进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，交由成都栢辉生物科技有限公司进行测序。将测序结果在GenBank比对并参考序列相偶联的文献，同时下载相似度较高的序列用于序列分析[11-13]（表2）。采用Clustal 1.83对测序的各个基因序列以及在GenBank下载的序列进行比对，比对后各个基因分别首尾相连，采用Paup 4.0 beta 10软件，最大简约法（Maximum parsimony，MP）进行分析，以启发式搜索法（Heuristic Search）构建多基因系统树，以确定菌株的分类地位。

表2 参与分子系统学分析的序列

2 结果与分析

2.1 供试大叶黄杨病叶的病害症状及病原菌初步鉴定结果

病斑多在新生枝叶及顶部叶片处发生，病健交界明显，病斑呈圆形、多角形或不规则形向外扩展。感病叶片先是变枯黄，后产生黑色小粒点，着生于叶表皮下，后期突破表皮外露，为分生孢子盘和分生孢子，严重时整个叶片枯萎（图1）。

图1 大叶黄杨叶枯病病症

图2 接种供试菌株后大叶黄杨叶片症状

分离的菌株纯化后得到2个菌株，编号LPSU2015001、LPSU2015002，经镜检初步鉴定引起当地大叶黄杨叶枯病的病原菌为拟盘多毛孢属真菌。

2.2 大叶黄杨病原菌致病性检测结果

室内接种结果表明，绝大部分健壮的大叶黄杨叶片在刺伤接种后均能被病原菌侵染，且病斑症状与供试大叶黄杨病叶相似，而无刺伤接种叶片均未发病，表明该病原菌只能从伤口侵染叶片。2个菌株刺伤接种后发病率均为60%。分离纯化后所得菌株菌落及分生孢子形态与原供试菌株一致。

2.3 大叶黄杨病原菌的形态学鉴定

经分离纯化，菌株LPSU2015001在PDA培养基上的菌丝呈白色絮状，生长速度11.1～11.4 mm/d，菌落边缘不整齐，背面浅黄色，菌丝致密，有同心环状纹饰（图3A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5细胞，（23.9～30.3）μm×（4.4～7.40）μm，中间3个色胞几乎同色，上2色胞深褐色，第3色胞颜色稍淡，分割处颜色特深，稍缢缩，顶胞无色，梯形或圆锥形，有2～3根附属丝，长14.5～29.8 μm，尾孢无色，圆锥形，具中生式柄1～2根，多1根，长6.3～12.8 μm（图3B、图3C）。寄主上，分生孢子4～5细胞，4细胞分生孢子无顶端透明孢，多5细胞，直或稍弯曲，（16.9～27.5）μm×（5.9～9.8）μm（图3D、图3E）；产孢细胞生于分生孢子梗顶端，棍棒形，无色，末端产分生孢子（图3F、图3G）。

图3 LPSU2015001纯培养及显微特征

菌株LPSU2015002在PDA培养基上菌丝洁白，呈棉絮状，分布均匀，菌落边缘不整齐，气生菌丝少，有同心轮纹，接种点周围菌丝稍稀疏，生长速率9.7～9.9 mm/d（图4A）；分生孢子堆黑色，分生孢子5细胞，（20.4～27.6）μm×（4.3～7.8）μm，中间3个色胞几乎同色，上2色胞深褐色，第3色胞颜色稍淡，分割处颜色特深，稍缢缩，顶胞无色，梯形或圆锥形，有1～2根附属丝，长9.4～21.4 μm，尾孢无色，圆锥形，具中生式柄1根，长4.8～7.7 μm（图4B、图4C）。寄主上，分生孢子4～5细胞，4细胞分生孢子无顶端透明孢，（16.5～36.7）μm×（4.8～9.9）μm，整体较小，具小瘤（图4D、图4E）；产孢细胞生于分生孢子梗顶端，棍棒形，无色，末端产分生孢子（图4F）。

图4 LPSU2015002纯培养及显微特征

2.4 大叶黄杨病原菌的分子生物学鉴定

将分离得到的2个菌株的ITS、β-tubulin、tef-1序列与从GenBank下载的同源性较高的序列（表2），以最大简约法，以Seiridium sp. SD096作为外类群，基于ITS、β-tubulin、tef-1序列构建多基因系统树（图5）。结果表明，LPSU-2015001与P.intermediaM亲缘关系较近，处于同一进化分支上，支持率为93%；LPSU2015002与P.trachicarpicola亲缘关系较近，处于同一进化分支上，支持率为79%，但两者支长差异较大。

图5 基于ITS、β-tubulin、tef-1部分序列构建的拟盘多毛孢属系统发育树

3 讨论与结论

大叶黄杨叶枯病是一种常见的植物真菌性病害，早在2006年，李庚花等[3]在对江西省大叶黄杨病害调查中，通过描述病原菌分生孢子大小，分生孢子器着生位置，鉴定该病的病原菌为半知菌亚门盘多毛孢属，并未对分生孢子及产孢细胞等形态特征作具体描述。贲海燕等在对北方花卉新病害的鉴定中，采用形态学鉴定的方法，描述了大叶黄杨叶枯病病原菌的分生孢子器以及PDA纯培养特征与显微特征，鉴定该病原菌为黄杨叶点霉，但其形态结构与李庚花等报道的差别很大。通过形态学鉴定，2个菌株的形态学特征均与前两者不同，观察纯培养特征及显微特征，初步判定2个菌株（LPSU2015001、LPSU2015002）均属于拟盘多毛孢属。

有关拟盘多毛孢属的分类，Steyaert[14]根据分生孢子的形态特征作为界定拟盘多毛孢的依据；Cuba[15]则设5细胞组以界定拟盘多毛孢属，两者均根据形态特征来划分种。但对于形态特征的测量及描述，各学者的研究结果均存在参差，且许多种的形态特征几乎相似，不同的人可能会将不同的种鉴定成同一个种，甚至会出现形态学与基因分析结果不相吻合的情况[16]。

参照Maharachchikumbura等[17-18]的研究，将分离到的2株菌与其在分子系统发育树中近缘种的形态特征相比，发现LPSU2015001的形态学特征与Maharachchikumbura等对P. intermedia的描述稍有差异，如寄主上，LPSU2015001分生孢子大小为（16.9～27.5） μm×（5.9～9.8）μm，而Maharachchikumbura等描述的是（24.0～28.0）μm×（5.5～6.5）μm，结合多基因系统发育树的结果，两者处于同一进化分支上，支持率为93%，因此可将LPSU2015001鉴定为P. intermedia。基于LPSU2015002多基因系统发育树的结果，其与P. trachicarpicola亲缘关系较近，但两者的支长相差大，且支持率仅有79%，在形态方面，LPSU2015002寄主上分生孢子较P. trachicarpicola长，顶端附属丝数量、长度、分生孢子细胞数量等差异较大，故不能将其分类单元定位到种，暂定为Pestalotiopsissp.。因此，此次在六盘水地区采样分离得到的疑似大叶黄杨叶枯病的病原菌为拟盘多毛孢菌株，其中菌株LPSU2015001为P. intermedia，菌株LPSU2015002暂定为Pestalotiopsissp.。