加工方式对富硒菜籽油中硒含量及形态变化的影响

◎ 何潇潇，周 健，马 懿，陈仁远

（1.四川轻化工大学，四川 自贡 643000；2.贵州省酒类产品质量检验检测院，贵州 仁怀 564500）

硒（Se）是人体必需的微量元素之一。近年来，富硒大米、富硒鸡蛋、富硒蔬菜、富硒茶叶等食品进入了人们的生活，各种富硒保健食品陆续被开发上市[1]。富硒菜籽油的开发，可使人们补充硒元素，提高人体免疫力及健康水平，还可促进区域特色农业和经济发展，对促进当地农民增产增收具有十分重要的意义[2]。

不同的加工方式会对含硒食品中硒的含量及形态、生物利用产生影响。PÉREZ 等[3]研究发现热处理对重要的硒-氨基酸有明显的影响。ZHOU 等[4]发现加工处理导致6.6%～45.9%的Se 损失，红豆杉的Se生物可及性为78.4%～89.7%；油炸处理降低了样品中的Se 生物可及性，而沸腾处理则增强了其Se 生物可及性。WANG 等[5]研究了富硒米粒中硒的生物利用度，发现硒蛋氨酸是易吸收的主要硒种类，同时富硒米粒的抗氧化生物活性明显提高。本文利用3 种不同加工方式（热榨、冷榨、浸出）加工生产出菜籽油，比较加工方式对其硒含量及硒形态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

富硒油菜籽、热榨油，贵州播州红食品有限公司；环己烷、石油醚、XIV 型蛋白酶，默克公司；硝酸、高氯酸、盐酸，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司；硒标准溶液[GBW（E）080215，浓度为100 mg·L-1]，中国计量科学研究院；硼氢化钾，默克公司；硒酸根标准溶液Se（VI）[GBW10033，浓度为（0.525f 0.017）μmol·g-1，以Se 计]、亚硒酸根标准溶液Se（IV）[GBW10032，浓度为（0.543f 0.016）μmol·g-1，以Se 计]、硒代胱氨酸标准溶液SeCys2[GBW10087，浓度为（0.560f 0.013）μmol·g-1，以Se 计]、硒 代蛋氨酸标准物质溶液SeMet[GBW10034，浓度为（0.499f 0.013）μmol·g-1，以Se 计]、甲基硒代半胱氨酸标准溶液SeMeCys[GBW10088，浓度为（0.433f 0.012）μmol·g-1，以Se 计]，中国计量科学研究院；胃蛋白酶、胰酶，天津市科密欧化学试剂有限公司；苹果酸钠、柠檬酸钠、乳酸、醋酸、氯化钠和胆盐，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸（色谱纯），天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

索氏抽提器（上海析达仪器有限公司SXT-06）；HPLC 仪（赛默飞UltiMate 3000）；双通道原子荧光光度计，配硒空心阴极灯（北京海光仪器公司AFS-9700）；美国CEM MARS-6 高通量密闭微波消解仪；赶酸仪（南京瑞尼克专用RNK-GS-24 石墨赶酸仪）；电感耦合等离子体质谱仪（赛默飞iCAP Q ICP-MS）。

1.3 实验方法

1.3.1 菜籽油的制备

富硒油菜籽、热榨油均由贵州播州红食品有限公司提供；冷榨油由冷榨油机制得；浸出油的制备参考方学智等[6]的方法制得。

1.3.2 硒含量的测定

硒含量参照《食品安全国家标准 食品中硒的测定》（GB 5009.93ü 2017）[7]第一法氢化物原子荧光光谱法测定，通过微波消解法对油菜籽和菜籽油进行前处理。

1.3.3 有机硒含量的测定

参照孙文丹等[8]的方法稍加改动，测出值为菜籽油中无机硒含量，再用总硒减去无机硒得到有机硒含量。

1.3.4 硒形态的测定

（1）仪器条件的优化。参考刘文政等[9]关于超声提取结合高效液相色谱-电感耦合等离子质谱（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）联用测定富硒山茶油中硒形态的方法，对仪器条件、样品处理等稍做修改。①HPLC 条件。CAPECELL PAK MG S5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为15 mmol·L-1柠檬酸溶液+2% 甲醇溶液（pH=4.4）；进样量为50 μL；柱温为室温。②ICP-MS条件。同心雾化器，雾化室温度为2 ℃；高纯氩气，载气流量为1.00 L·min-1；蠕动泵转速为0.3 r·s-1；射频功率为1 500 W；测质量数为78 Se；采样深度为8 mm；采集时间为600 s；采样周期为0.8 s。

（2）样品前处理的优化。通过比较3 种前处理方法的提取率对样品前处理过程进行优化。①水+超声提取法。称取菜籽油1.00 g 于50 mL 离心管中，加入20 mL 超纯水，混匀超声萃取2 h。将萃取的清液吸取转移至15 mL 离心管中，再以10 000 r·min-1转速离心10 min，过滤待测。②酸提取法。称取菜籽油1.00 g 于50 mL 离心管中，加入20 mL 柠檬酸溶液（5 mmol·L-1），放入恒温水浴振荡器（37 ℃）中提取24 h，放入离心机中，转速设置为10 000 r·min-1，离心10 min，过滤待测。③酶提取法。准确称量1.00 g菜籽油于50 mL 离心管中，加入10 mL 三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（30 mmol·L-1，pH=7.5）和0.02 g XIV 型蛋白酶，放入涡旋机中涡旋混匀，再放入恒温水浴振动器中（37 ℃）振荡24 h，取出放入离心机中，转速设置为10 000 r·min-1，离心10 min 后，过滤待测。

（3）样品硒形态的测定。按照优化得到的最佳样品处理方法，对菜籽油中的硒进行提取后，将样品溶液上机进行测定。根据标准溶液的色谱保留时间定性，根据标准曲线得到样品溶液中各硒形态的浓度，如某一样品响应值超出标准曲线线性范围，将其进行稀释后重新上机测定。

1.3.5 菜籽油的体外生物利用度的测定

参考LI 等[10]的方法，对富硒菜籽油中的硒体外生物利用度进行了人体胃肠模拟消化实验，通过模拟人的胃肠环境，计算菜籽油中硒的生物利用度情况。具体方法如下。①在胃液里的模拟消化阶段。称取1.00 g菜籽油样品，加入50 mL 胃液（成分见表1）后放入37 ℃恒温水浴振荡器中振荡1 h，取出冷却至室温后，放入离心机，设置离心机转速为8 000 r·min-1，离心10 min，倒出上清液即胃液消化法的“胃液”。②在肠液里的模拟消化阶段。将胃液的pH 值调整为7，加入5 mL 肠液（成分见表1）中，置于37 ℃恒温水浴振荡器中振荡4 h，取出冷却至室温后，放入离心机，设置离心机转速为8 000 r·min-1，离心10 min，取上清液得到“肠液”样本。根据硒含量和硒形态测定的方法对经过胃肠消化后的样本进行总硒和硒形态分析。

表1 胃、肠液成分表

硒生物利用度的计算公式为生物利用度=胃肠消化液中的硒含量/菜籽油中的硒含量×100%。

2 结果与分析

2.1 不同加工方式对菜籽油总硒损失的影响

因油脂属于较难消化的样品之一，在迅速升温、温度过高的情况下极易碳化爆炸，选择前处理方法时需考虑这些特殊性。本研究采用微波消解方式使得强酸的消耗少了很多，一定程度上降低了操作的复杂性，最后测得不同加工方式菜籽油中硒含量见表2。油菜籽在加工过程中，3 种加工方式均对硒含量造成一定量的损失，损失程度为冷榨＜浸出＜热榨，这与ZHANG 等[11]关于富硒马铃薯块茎烹饪过程中硒损失及产品质量变化的研究结论相符。热加工的方式是造成硒损失的一种重要原因，另外在压榨挤压过程和有机试剂的浸取过程中，也会造成硒损失。刘宇[12]在研究不同加工方式对玉米硒含量的影响时发现，不同的粉碎粒径造成玉米总硒、有机硒的量逐渐减少，蒸制和炒制处理对硒含量的影响最大。

表2 油菜籽和菜籽油中硒含量表

2.2 不同加工方式对菜籽油硒形态的影响

2.2.1 前处理方法的选择

比较了3 种前处理方法对样品中各种硒形态提取率的影响，结果见表3。水+超声提取法的硒形态提取率仅为11.20%，酸提取法的硒形态提取率也仅为23.59%，这两种方法提取率不佳的原因可能为菜籽油中的有机硒含量占比较大，而无机硒占比较少，两种方法中提取出的硒形态主要为水溶态的硒和很少量的有机硒。

表3 不同前处理方法对硒形态的提取率表

酶提取法中，在蛋白酶的作用下，能将大部分的有机硒提取，提取率为58.66%，远大于其他两种方式，并且能同时有效地将菜籽油中5 种硒形态提取出来。因此，本研究采用酶提取法对菜籽油进行前处理。

2.2.2 回收率和精密度

加标回收实验结果见表4。Se（VI）的加标回收率在92.4%～101.0%，Se（IV）的加标回收率在96.9%～97.6%，SeCys2 的加标回收率在76.8%～89.6%，SeMet 的加标回收率在81.0%～87.7%，SeMeCys 的加标回收率在79.6%～88.9%；RSD 在1.1%～4.5%，RSD ＜5%，证明本研究方法准确性高、精密度好，可应用于实际菜籽油样品硒形态的检测。

表4 富硒菜籽油样品的加标回收率表（n=6）

2.2.3 不同加工方式菜籽油中的硒形态含量

实际菜籽油样品检测结果见表5，菜籽油总硒提取率在54.96%～60.43%，而有机硒提取率在60.63%～67.12%，证实了本研究中前处理方法对有机硒形态提取的有效性。

表5 不同加工方式富硒菜籽油硒形态含量表（n=3）

不同加工方式的富硒菜籽油中各种硒形态的分布有所不同，热榨油中不同硒形态含量排序为SeMet ＞SeCys2 ＞Se（VI）＞SeMeCys ＞Se（IV）；冷榨油中不同硒形态含量排序为SeMet ＞SeCys2 ＞SeMeCys ＞Se（VI）＞Se（IV）；浸出油中不同硒形态含量排序为SeMet ＞SeMeCys ＞Se（VI）＞SeCys2 ＞Se（IV）。不同加工方式的菜籽油中硒形态SeMet 含量均为最高，在热榨、冷榨、浸出油中占比分别为26.84%、30.06%、27.82%，在冷榨油中占比最高。

王铁良等[13]采用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱法测定市售富硒芝麻、花生、核桃等高脂作物中的硒形态，发现高脂作物中的硒赋存形态为硒代蛋氨酸。林樾等[14]发现不同碎米荠样品中硒形态分布也不完全相同，其中主要形态为有机硒SeCys2 和SeMet，且发现了样品中还存在未知形态的硒。侯传丽[15]的研究中，高硒黑小麦中硒形态主要以硒代蛋氨酸形式存在。这都说明在多种富硒农产品中SeMet 都是最主要的硒形态，与本研究的结论相符。

2.3 不同加工方式对菜籽油有机硒含量的影响

3 种不同加工方式的菜籽油中有机硒含量见表6，计算得有机硒占总硒含量的比值依次为冷榨＞热榨＞浸出。LI 等[16]发现亚硒酸钠被小麦吸收后转化为硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代蛋氨酸氧化物（SeOMet）和硒代甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）等有机状态，也就能说明油菜作为次级硒积累植物可吸收土壤中的无机硒并将其有效转化为有机硒。祝华明等[17]也经实验测得油菜籽中有机硒占总硒的87.65%，压榨油和浸出油中的硒都以有机硒形式存在。

表6 不同加工方式菜籽油总硒与有机硒含量表

冷榨的加工方式不论是对总硒还是有机硒含量的影响，都优于热榨和浸出的加工方式，可能是因为硒蛋白在有机硒中占比较高，而热处理的方式会导致硒蛋白的稳定性变差，从而发生形态和价态的变化，最终使得有机硒含量降低；而浸出过程中有机溶剂的使用可能对有机硒溶出造成损失。多项研究指出，食物中的有机硒对人体的生物利用度远高于无机硒，所以未来富硒食品营养价值的评定或可将有机硒含量占比作为一项重要指标。

2.4 不同加工方式对菜籽油生物利用度的影响

富硒菜籽油中硒的体外生物利用度测定结果如表7 所示。从总硒含量来看，经过胃肠体外消化后，热榨、冷榨、浸出油的体外生物利用度分别为26.19%、30.88%、27.16%，说明不同加工方式的菜籽油硒的生物利用度不同，且进入人体后不能完全被吸收，可能是因为不同加工方式菜籽油中各形态硒的含量和比例有差别，以冷榨加工方式处理的菜籽油生物利用度最佳。所以，从各硒形态含量来看，Se（IV）在胃肠消化液中未检出，热榨油中仅检出了3 种硒形态，生物利用度从高至低依次为SeMet ＞SeCys2 ＞Se（VI）；冷榨油中检出4 种硒形态，生物利用度从高至低依次为SeMet ＞SeCys2 ＞SeMeCys ＞Se（VI）；浸出油中检出4 种硒形态，生物利用度从高至低依次为SeMet ＞SeMeCys ＞Se（VI）＞SeCys2。其中，4 种不同加工方式的菜籽油中SeMet 生物利用度均大于50%，均高于SeCys2 和SeMeCys 两种有机硒形态，更高于Se（VI）、Se（IV）两种无机硒形态生物利用度2 倍及以上。JARAMILLO 等[18]研究发现幼年杂交条纹鲈鱼的硒代蛋氨酸的生物利用度比亚硒酸钠高3.3 倍。这说明冷榨方式处理的菜籽油生物利用度高的原因是可能是SeMet 形态含量较高，与XIA 等[19]的研究结论相符。

表7 不同加工方式富硒菜籽油的体外生物利用度表

2.5 不同加工方式处理菜籽油体外胃肠消化后硒形态的影响

不同的加工方式会影响食品中营养物质的吸收利用，人们认为的生物可利用度是食物中的硒能通过胃肠消化保留下来，被人体所吸收，而不能通过胃肠膜吸收的部分将直接排出，而不影响身体运行机制。如图1、图2、图3 所示，3 种不同加工方式的菜籽油中SeMet 在胃肠消化前后保留含量均最高，说明其最易于被人体吸收，生物利用度高，反之Se（Ⅳ）在经胃肠消化后无含量保留，所以其很难被人体吸收利用。SeMet 生物利用度高的原因可能是蛋氨酸tRNA 不能区分Met 和SeMet，因此SeMet 可以非特异性地替代Met 进入肌肉蛋白质，形成含Se 的蛋白质，而其他形式的Se 形态则不能被储存，需转化为硒化氢后才能加入硒蛋白合成途径[20]。

图1 热榨加工方式胃肠体外消化前后硒形态变化图

图2 冷榨加工方式胃肠体外消化前后硒形态变化图

图3 浸出加工方式胃肠体外消化前后硒形态变化图

冷榨加工除SeMet 外也更利于SeCys2、SeMeCys两种有机硒的吸收，总的硒形态物质的吸收利用也更高。浸出法加工后的硒形态除SeMet 以外SeMeCys 保留也较高；但热榨法加工后的硒形态除SeMet 以外保留含量均很低。这可能是因为热榨法在加工过程中的理化指标和其他微量活性物质的变化相比于冷榨和浸出方式较大，周诗悦等[21]认为食品中大分子基质组分与硒也可能存在相互作用。

3 结论

本研究通过制取3 种不同加工方式（热榨、冷榨、浸出）的菜籽油对其硒含量、有机硒含量、硒形态和体外生物利用度进行研究，发现菜籽油在加工过程中，会造成硒不同程度的损失，且热榨处理后的硒损失最大，而通过冷榨处理的菜籽油中有机硒含量占总硒比更高。通过比较发现冷榨油的体外生物利用度较高，SeMet 是菜籽油中最主要的硒形态，且其生物利用度在3 种不同加工方式的菜籽油中均大于50%，高于Se（VI）、Se（IV）两种无机硒形态生物利用度2 倍及以上。因本研究对富硒菜籽油的生物利用度情况只进行了体外模拟消化实验，如要进一步探究人体对其吸收利用的有效性，还需进行动物实验模拟人体内硒的消化吸收利用。