超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的喹烯酮

王 鑫， 杨发树， 杜雪莉， 张凤枰

（1.四川威尔检测技术股份有限公司，四川 成都 610041；2.通威股份有限公司，农业农村部水产畜禽营养与健康养殖重点实验室，四川省水产健康养殖重点实验室，四川 成都 610093）

喹烯酮是我国自主研发的一种喹噁啉类药物，具有喹噁啉-1，4-二氧化物结构，能够抑制细菌DNA 的合成，与喹乙醇和卡巴氧等传统的噁喹酸类药物相比，喹烯酮的毒性副作用大大降低。自产品商业化以来， 其作为有效抗菌的饲料添加剂在国内畜禽业被广泛使用。 2020 年7 月1 日以来， 随着农业农村部第194 号、246 号公告的实施，除了金霉素预混剂等15 个兽药产品、拉沙洛西钠预混剂等5 个进口兽药产品可作为抗球虫类药物饲料添加剂使用外， 饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂 （中药类除外）的商品饲料。准确定性定量测定饲料中的喹烯酮具有重要意义，这就对饲料中喹烯酮药物残留检测提出了更高的要求。超高效液相色谱串联质谱仪具有高灵敏度、高特异性、检测时间快速的特点。近年来，顾亮（2010）、刘雪红（2016）、曹忠君（2020）等采用高效液相-串联质谱法检测饲料中的喹烯酮。本文采用与喹烯酮极性更为相近的提取液进行提取， 并且采用正己烷除脂而不使用SPE 小柱净化，在节省成本、提高效率的同时保持较高的灵敏度。 目前，饲料中喹烯酮测定的国家标准大多采用农业部2086 号公告-5-2014《饲料中卡巴氧、乙酰甲喹、喹烯酮和喹乙醇的测定液相色谱-串联质谱法》完成，由于喹烯酮属于非极性化合物，而采用极性溶液提取、净化，检测结果准确性、重现性较差。 本文根据喹烯酮的理化性质，从液相色谱质谱条件、样品提取、净化方式、检出限和定量限等方面开展系统研究，旨在建立适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中喹烯酮残留的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测方法，为饲料中喹烯酮快速准确测定提供方法依据，保障我国饲料的质量安全。

1 材料与方法

1.1 仪器设备、试剂和样品 UPLC-TQD 超高效液相色谱-串联质谱仪 （沃特世公司）；AB204-E电子分析天平（赛多利斯公司）；Allegra 64R 高速冷冻离心机（贝克曼公司）；涡旋仪（上海金怡公司）；自动化氮吹仪（厦门睿科公司）；超声清洗仪（昆山洁力美公司）。

乙腈、乙酸乙酯、正己烷、甲酸等（色谱纯，四川科隆公司）；喹烯酮标准物质（纯度≥99.0%，德国Dr 公司）；超纯水（美国Millipore 公司）。

猪配合饲料、猪浓缩饲料、肉牛精料补充料、猪复合添加剂预混合饲料， 由四川威尔检测技术股份有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 试样溶液制备 称取试样2 g （精确至0.0001 g）于50 mL 离心管中，准确加入10 mL 提取液（乙腈：乙酸乙酯=50：50），涡旋振荡2 min，超声提取10 min，12000 r/min 离心3 min，将上清液转移至另一50 mL 离心管中，残渣中再次准确加入10 mL 提取液，重复提取一次。 合并两次上清液、混匀备用。 准确移取1.0 mL 上清液至玻璃氮吹管中， 于50 ℃氮气吹干。 准确加入1.0 mL 20%乙腈水溶液复溶，涡旋振荡20 s；加入3 mL正己烷，涡旋振荡10 s，转移全部液体至塑料离心管中，12000 r/min 离心3 min。 将下层溶液过0.22 μm 有机系滤膜，上机测定。 全程避光操作。

1.2.2 基质匹配标准溶液制备 称取5 个空白样品基质，按照1.2.1 中的提取，分别准确取1 mL 空白基质提取溶液于玻璃氮吹管中，准确移取适量喹烯酮标准储备溶液于5 个空白基质溶液中，于50 ℃氮气吹干。 准确加入1 mL 20%乙腈水溶液复溶，涡旋振荡20 s，加入3 mL 正己烷，涡旋振荡10 s，转移全部液体至塑料离心管中，12000 r/min离心3 min，将下层溶液过0.22 μm 有机系滤膜，配制成浓度分别为1.035、2.069、4.138、20.69 ng/mL和103.5 ng/mL 基质匹配标准系列溶液。

1.2.3 色谱参考条件 色谱柱：C18柱，2.1 mm×100 mm，1.8 μm；流动相A：乙腈；流动相B：0.2%甲酸水；梯度洗脱程序见表1；流速：0.3 mL/min；进样体积：3 μL。

表1 梯度洗脱程序

1.2.4 质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式： 正离子扫描； 检测方式： 多反应监测MRM；毛细管电压：3.0 kv；离子源温度：150 ℃；去溶剂温度：350 ℃；去溶剂流速：650 L/h；锥孔气流速：50 L/h；定性离子对、定量离子对和对应的仪器条件参考值见表2。

表2 定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量

2 结果与分析

2.1 喹烯酮的化学性质 从喹烯酮化学结构式可以看出，喹烯酮具有喹噁啉环和苯环结构，因此该化合物的极性较弱。

使用初始流动相分别配制上机浓度为1.035、2.069、4.138、20.69 ng/mL 和103.5 ng/mL 标准系列溶液，过滤膜后上机测定。同时向相同浓度的标准系列溶液分别加入3 mL 正己烷， 涡旋振荡10 s后离心，取下层液体过滤膜上机测定。从表3 结果可以看出， 不同浓度的喹烯酮标准工作液的响应值下降了17% ～23%。 根据相似相溶原理，该结果也反映了喹烯酮弱极性的化学性质。

表3 喹烯酮标准系列溶液响应值

2.2 提取溶液的选择 通过查阅相关文献发现，喹烯酮的主要提取溶剂有乙腈（金晓峰，2019；刘慧慧，2015）、乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）（马晓年，2020；徐英江，2011）、乙酸乙酯（马晓年，2020；尹怡，2013）、二氯甲烷-乙酸乙酯（3：1，V/V）（刘文静，2020）、甲醇-乙腈（1：1，V/V）（丁振华，2013；顾亮，2010）、乙腈-0.1%甲酸水（3：2，V/V）（贾铮，2020；曹忠君，2020；贾涛，2015）。考虑到乙腈是良好的除蛋白剂，同时渗透作用强，能高效提取饲料中的目标化合物；喹烯酮作为弱极性化学物质，在乙酸乙酯中具有良好的溶解性，本文采用乙腈、乙酸乙酯和乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）作为提取溶液，基质匹配标准曲线校正，外标法定量，结果见表4。 喹烯酮在乙酸乙酯中具有良好的溶解性，同时考虑到乙腈的除蛋白和强渗透作用， 故采用乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）作为喹烯酮提取溶剂。

表4 不同提取溶液对喹烯酮的提取效率（n=3）

2.3 提取方式的确定 液相色谱和液相色谱-串联质谱常见有效的提取方式为涡旋振荡使样品与提取液充分混匀接触、超声清洗仪超声提取。本研究对超声时间和超声次数进行了比较。结果表明，超声2 次， 每次超声10 min 是最有效的提取方式。 不同提取方式结果见表5。

表5 喹烯酮在不同提取方式下的回收率（n=3）

2.4 分取体积及净化方式的确定 液相色谱-串联质谱分析主流的净化方式主要有正己烷除脂净化、固相萃取小柱净化、QuECHERS 快速净化、免疫亲和小柱特异净化等。 通过前期实验发现，喹烯酮在仪器上的响应很高。 因此本文在保证取样精确度的情况下，尽可能减少分取体积，同时采用最高效的正己烷除脂净化方法，达到高效、高性价比的测量喹烯酮的目的， 同时降低样品基质对仪器的影响。 故本实验确定分取体积为1.0 mL。

2.5 正己烷加入量的确定 喹烯酮属于弱极性化合物，加入正己烷后响应会降低约20%。 本研究通过加入1、2 mL 和3 mL 的正己烷除脂净化，上机测定回收率来选择适合的正己烷加入量，回收率情况见表6。 结果表明，正己烷的加入量对回收率影响很小。虽然喹烯酮会部分溶解在正己烷，造成含量的丢失， 但同时正己烷也能净化饲料样品中其他脂溶性物质，降低基质效应，增加喹烯酮检测的灵敏度。 综合考虑，本实验采用3 mL 正己烷除脂净化。

表6 不同体积正己烷除脂净化后喹烯酮的回收率（n=3）

为了保证结果的可靠性， 本研究同时做了3个梯度的加标实验， 结果见表7。 回收率数据表明，3 mL 正己烷除脂净化既能满足实验结果的要求，也能达到降低基质响应的目的。

表7 正己烷除脂净化后不同加标浓度的喹烯酮回收率（n=3）

2.6 复溶涡旋振荡时间的确定 喹烯酮的检测属于反相液相色谱分离，洗脱梯度程序遵循从低比例的有机相到高比例有机相的变化。为了保证色谱峰的峰形正常，一般采用与初始流动相比例一致的复溶液。 喹烯酮属于弱极性化合物，在高比例的水相中溶解度不高，因此复溶涡旋振荡的时间非常重要。本研究采用涡旋振荡后加入3 mL正己烷除脂净化，过滤膜后上机测定。 涡旋振荡时间分别为10 s 和20 s，不同饲料类别、不同加标量的喹稀酮加标回收率结果见表8。 结果表明，10 s 涡旋振荡时间后上机测定的喹烯酮回收率在所有的样品中偏低， 且相对标准偏差大，无法满足方法性能参数的要求。20 s 涡旋振荡时间后上机测定的喹烯酮回收率为89.6% ～116.0%，相对标准偏差为3.44% ～7.19%，结果重复性、稳定性好、可信度高。

表8 喹烯酮在4 种饲料中的回收率（n=6）

2.7 线性范围和回归方程 按照1.2.2 的操作制备基质匹配标准曲线。 在仪器最佳工作条件下，对基质匹配标准溶液进样，以峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线。 4 种饲料的喹烯酮线性关系、相关系数见表9。

表9 喹烯酮的线性范围、回归方程和相关系数

2.8 检出限、定量限和回收率 在空白样品基质中加入喹烯酮标准溶液， 用以上优化确定的条件进行样品提取、样液净化、上机测定后，再通过信噪比计算得出喹烯酮的检出限为6.0 μg/kg、定量限为20.0 μg/kg。空白基质中添加量为20.0 μg/kg的喹烯酮特征离子色谱图见图2。

图2 空白基质中添加量为20.0 μg/kg 的喹烯酮特征离子色谱图

根据确定的检测条件和定量限， 选择猪配合饲料、猪浓缩饲料、肉牛精料补充料及猪复合添加剂预混合饲料作为样品基质，每6 个样品为1 组，分别添加1 倍定量限、2 倍定量和10 倍定量限标准溶液，完成喹烯酮的回收率和精密度实验，实验结果见表10。

结果表明， 在41.832 ～418.32 ng 加标水平下，猪配合饲料中喹烯酮的平均回收率为102.1%～116.0%，相对标准偏差为3.89% ～6.35%；猪浓缩饲料中喹烯酮的平均回收率为92.1% ～102.7%，相对标准偏差为3.79% ～7.19%； 肉牛精料补充料中喹烯酮的平均回收率为95.4% ～99.5%，相对标准偏差为3.44% ～4.12%； 符合猪复合添加剂预混合饲料中喹烯酮的平均回收率为89.6% ～98.0%，相对标准偏差为4.11% ～4.84%。 检测结果灵敏度和稳定度好。

3 结论

本实验通过在样品中加入乙腈-乙酸乙酯（1：1，V/V）分2 次超声提取，准确分取1.0 mL 提取液氮吹，复溶后加入正己烷除脂净化，过滤膜后上机测定喹烯酮含量的操作， 建立了饲料中喹烯酮的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。 通过对样品前处理条件和仪器性能条件的优化， 方法的检出限为6.0 μg/kg、定量限为20.0 μg/kg，4 种饲料喹烯酮回收率为89.6% ～116.0%、相对标准偏差为3.44% ～7.19%。 该检测方法操作简单、快捷，检测结果灵敏、稳定，可满足饲料中喹烯酮残留量的检测需求。