一株禽多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

杨宗琛，胡巧云，王昌建，唐小明，王卫国，彭志，谢怡灵，张坤，黎满香，刘武函，唐亚新，范仲鑫※

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410007）

前言

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）在世界各个地区都有分布，是巴氏杆菌科巴氏杆菌属的主要代表菌之一。Pm 是一种可以感染多种动物的细菌性病原体，可感染禽类动物包括鸡、鸭、鹅、火鸡等，致使产蛋率下降；可感染一些常见的家畜，例如猪、牛等，对这些动物的生命构成严重的威胁。在18 世纪中后叶，法国学者Chabert 和Mailer 在对该疾病进行研究后，将其命名为“禽霍乱”[1]。禽霍乱的研究历史已有100 多年，其传播力、致病力严重阻碍了养禽业经济的发展[2]。

Pm 为革兰氏阴性菌，需氧和兼性厌氧。形态多为短杆状或球杆状，芽孢和菌毛均不存在，菌体表面有荚膜。Pm 生长所需要的适宜酸碱度在7.2～7.6，温度为37℃，可以在血平板、TSA 或者TSB 培养。多杀性巴氏杆菌为条件性致病菌，可存在于健康家禽的呼吸道中，当环境或者其他原因引起家禽发生应激反应而导致其抵抗力下降时，就会引起禽霍乱的发生。急性型的禽霍乱发病非常迅速，明显症状出现后在短时间内就会死亡并且死亡率极高。慢性型的禽霍乱也会引起鸡发病，并且使母鸡的产蛋率大大下降。

目前对于Pm 主要是通过荚膜和脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）来进行分型，荚膜型可分为A、B、D、E、F 五种，脂多糖型可分为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8 八种[3]。禽霍乱、家兔巴氏杆菌病和牛呼吸系统病等疾病多为荚膜A 型引起；荚膜B型和E 型通常引发的疾病是牛出血性败血症；荚膜D 型和A 型会感染猪发生猪萎缩性鼻炎[4]。脂多糖是革兰氏阴性菌外膜重要的组成成分，也是其主要的毒力因子，在感染宿主的过程中发挥重要的作用。本试验对湖南省某养鸡场疑似禽霍乱的鸡只进行了解剖、病原菌的分离鉴定，通过16S rDNA 序列分析、荚膜和脂多糖PCR 分型研究了病原菌的生物学特性，以确定其致病病原。

1 材料

1.1 发病情况

湖南省某养鸡场林下养鸡500 余只，2023 年2月鸡群开始陆续发病2 个月余，死亡200 多只。送检发病鸡3 只、病死鸡3 只。

1.2 主要试剂及仪器

病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司，革兰氏染色液购自广东环凯微生物科技有限公司，PCR 反应所用HiFi PCR Super Mix、6× DNA loading Buffer、2 × Trans Taq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix I（-dye）购自北京全式金生物技术有限公司，胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、接种培养液、全自动微生物鉴定药敏分析仪（BD PhoenixTM M50）均购自碧迪医疗器械（上海）有限公司。

2 方法

2.1 细菌的分离培养

在无菌的条件下取肝脏、肺脏和脾脏组织，用接种环接种在TSA 培养基上，置于恒温培养箱中，在37℃条件下培养16 h；待长出单个菌落后，在无菌的条件下用接种环挑取菌落接种于新的TSA 中进行纯化培养12 h。重新长出菌落后，对细菌进行革兰氏染色，镜下观察细菌的形态学特征。

2.2 细菌分离株的生化鉴定

采用全自动微生物鉴定与药敏分析仪鉴定了48 项生化指标。

2.3 细菌分离株16S rDNA 扩增测序

无菌条件下，将TSA 中单个菌落用接种环接种到TSB 中，并放入37℃、220 r/min 恒温培养振荡器中培养12 h，收集菌体，提取基因组核酸，将其作为模板，使用通用引物16S rDNA PCR 引物扩增，引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增后取PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳试验，得到目的片段后送北京擎科创新生物科技有限公司测序。将测序结果在GenBank 中用BLAST 进行序列比对并利用MEGA 软件进行遗传进化分析。

表1 16S rDNA 引物序列信息

PCR 扩增体系：2 × Trans Taq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板5 μL，ddH2O 5.5 μL。

PCR 扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共30 个循环；72 ℃再延伸5 min。

2.4 荚膜与脂多糖分型

参考设计的荚膜分型引物（见表2）和脂多糖分型引物（见表3）进行PCR 扩增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物

表3 多杀性巴氏杆菌脂多糖分型引物

3 结果与分析

3.1 临床表现及剖检症状

送检的3 只发病鸡表现不愿走动、被毛蓬乱、头颈下垂、鸡冠绵软、肛门处有黄白色稀粪的症状。剖检后，肝脏和肺脏发现明显病变，胸腔中存在泡沫样积液（见图1）。

图1 剖检病理变化

3.2 细菌的分离纯化及镜检

分离纯化后的细菌在TSA 培养基培养12h 后生长出边缘圆润，表面光滑的乳白色半透明状菌落（见图2），经革兰氏染色后镜检，镜下（×100）呈红色短杆状（见图3）。

图2 TSA 培养基培养12h

图3 革兰氏染色镜检（×100）

3.3 生化鉴定培养结果

细菌鉴定仪鉴定：L -亮氨酸-AMC、多粘菌素E、多粘菌素B、P_BPHOBIS（PNP）磷酸盐、DEDX－TROSE、蔗糖、ALPHA -酮戊二酸为阳性，其余指标均为阴性（见表4），鉴定结果为多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida），可信值：99%。

表4 巴氏杆菌生化鉴定结果

3.4 16S rDNA 的鉴定

分离菌用16S 引物进行PCR 扩增后得到约1450 bp 的目的片段（见图4），符合预期的结果。经测序后得到16S rDNA 序列的长度为1443 bp。在NCBI 参考CCUG 17978、CCUG 17976 和英国株NCTC 10322、NCTC 10204 的16S rDNA 序列进行比对并进行同源性分析（见图5）经比对与巴氏杆菌美国株CCUG17978 的同源性最高，同源性为100%。因此，分离株为巴氏杆菌属。

图4 巴氏杆菌16S rDNA 基因扩增

图5 巴氏杆菌16S rDNA 基因序列同源性分析

3.5 巴氏杆菌荚膜分型

用荚膜分型的引物对模板进行扩增后，仅的到荚膜A 型的目的片段，大小约1044 bp，符合预期的片段长度（见图6），其他泳道均无条带，证明HN-A-1 菌株为荚膜A 型，引用中所参考的国内外A、B、D、E、F 荚膜型菌株进行同源性比对进行同源性分析（图7）并构建系统进化树（图8），结果HNA-1 与A 型荚膜参考株的同源性在99%以上，证明该分离株荚膜型为A 型。

图6 巴氏杆菌荚膜分型扩增

图7 巴氏杆菌荚膜分型核苷酸序列同源性的比较

图8 巴氏杆菌荚膜分型进化树

3.6 脂多糖分型

用L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8 八种脂多糖分型引物扩增后，仅L1 型引物扩增出约1307 bp 的目的片段（图9），测序结果与GenBank 中L1 型巴氏杆菌VP161 的同源性为100%。证明HN-A-1 菌株为脂多糖L1 型。

图9 脂多糖分型扩增

4 治疗措施

该养殖场给鸡用磺胺类药物配合小苏打混用，治疗3～5 天后，症状明显好转。

5 讨论与结论

禽霍乱传播速度非常快，发病率较高[8]，特别是急性病症，会造成大量禽类死亡，母鸡产蛋率下降，给养禽业造成巨大的经济损失。本研究从发病鸡场得到的菌株经分离鉴定，为多杀性巴氏杆菌，且为致病力较强荚膜A 型、脂多糖L1 型。这与王林柏[8]等、Li[9]等报道国内部分地区禽源多杀性巴氏杆菌血清型结果一致，主要为A：L1 型，也与Peng 等报道全球不同地区的流行情况相同。

该鸡场养殖三年有余，饲养过程中对于卫生环境等因素的把控存在一定的疏漏，这也是诱发禽霍乱的关键因素之一。鸡场养殖会出现各种各样的状况，天气突变、禽舍通风不良、生活环境过于潮湿、脏乱以及营养缺乏等让鸡群产生应激，都可能会导致其免疫力下降而感染禽霍乱[10]。保持禽舍的卫生、通风、温度、湿度和合理饲喂，才能更大可能减少禽霍乱的发生。

由于禽霍乱是细菌性疾病，所以抗生素例如磺胺类药物、氟苯尼考等都可以对禽霍乱进行有效的防治。本试验所得样本的鸡场饲养方式为林下养鸡，平时用药较少，所以在给鸡用磺胺类药物配合小苏打进行治疗后鸡群逐渐恢复正常。近年来，由于市场上抗生素的滥用，导致许多畜禽动物对与抗生素都有了一定的耐药性[11]，导致药物原有的有效剂量失效。所以在饲养过程中还要避免为预防各种疾病滥用抗生素，使其保持一个自然良好的生长状态[12]。