雷公藤甲素对舌鳞癌细胞自噬的影响及相关机制研究

杨吉垒 杜艳秋 温晓霞 刘华蔚

雷公藤甲素(Triptolide,TP)是从中药雷公藤中提取的有效单体,具有免疫调节、抗炎等经典作用[1]。随着研究的深入,大量实验表明雷公藤甲素还可通过各种途径发挥抗肿瘤作用。研究证实雷公藤甲素能够抑制线粒体已糖激酶II从而诱导头颈部肿瘤焦亡[2]。在卵巢癌细胞中,雷公藤甲素能够抑制JAK2/STAT3信号,通过ROS生成诱导致死性自噬[3]。本研究通过一系列体外实验,研究雷公藤甲素对人舌鳞状细胞癌自噬的影响,并研究自噬在其抗肿瘤过程中的作用以及可能的信号转导途径。

1 材料与方法

1.1 细胞以及主要试剂

人舌鳞癌细胞系CAL-27和SCC-25(中国科学院细胞研究所);TP(Sigma公司,美国);DMEM高糖液体培养基、F12液体培养基、青霉素/链霉素双抗、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司,美国);四甲基偶氮唑蓝(MTT)粉末(南京生兴生物技术有限公司);AnnexinV-PI细胞凋亡双染试剂盒(Becton Dickinson公司,美国);MDC荧光染色试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司);ECL超敏化学发光试剂盒(南京碧云天生物技术研究所);LC3、ATG3、ATG7、PARP、cleaved PARP、Caspase-9、cleaved Caspase-9、STAT3、PIM-1、β-actin抗体、HRP 标记山羊抗鼠/抗兔 IgG(Abcam 公司,英国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 CAL-27细胞使用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素),SCC-25细胞使用F12培养基(含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素)。恒温CO2培养箱(5%CO2,37 ℃)培养,细胞密度达到70%～85%时传代,使用对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MDC染色法测定细胞自噬情况 分别取生长状态良好且对数生长期的CAL-27细胞和SCC-25细胞,按5×104个细胞/孔的密度接种于24 孔板爬片上,用终浓度10 μg/L的TP分别处理细胞24 h后,避光加0.05 mmol/L的MDC染液(100 μL/孔)避光室温孵育约40 min,用抗荧光猝灭剂封片,激发波长为355 nm和发射波长为512 nm的绿色荧光进行观察拍照。

1.2.3 MTT比色法测定细胞存活率 将CAL-27细胞接种于96 孔板(195 μL/孔),恒温CO2培养箱(5%CO2,37 ℃)中孵育24 h,。细胞贴壁后,以每孔5 μL的体积加入TP(终浓度为2.5、5、10、15、20、30 μg/L),每组浓度设3 个平行孔(空白组加入5 μL的DMSO),继续培养48 h。避光加入MTT工作液(5 mg/mL,20 μL/孔),在细胞培养箱中静置反应4 h。弃尽96 孔板中的溶液,向每孔中加入120～150 μL DMSO溶液,待结晶完全溶解后,使用酶联免疫检测仪在570 nm波长处检测各孔的吸光度值。细胞增殖抑制率=(对照组A570值-TP处理组A570值)/对照组A570值100%。

1.2.4 Western Blot实验测定细胞中相关蛋白表达情况 取处于对数生长期且状态良好的CAL-27细胞接种至六孔培养板中,待细胞完全贴壁后,换含有不同浓度TP(5、10、20 μg/L)的培养基作用不同时间(12、24、48 h)。收集细胞并提取蛋白,使用BCA法进行蛋白定量,每孔上样30 μg,8%～12%SDS-PAGE凝胶电泳分离目标蛋白,湿转至PVDF膜上,5%现配脱脂奶粉室温封闭液封闭1 h,TBST洗脱3 次,一抗(1:10 000稀释)4 ℃孵育过夜,TBST洗脱3 次,二抗(1:1 000稀释)室温孵育2 h,TBST洗脱,ECL化学发光显色,Bio-Rad凝胶成像分析仪(Gel Doc XR,伯乐,美国)中曝光,成像。使用Image J系统定量分析目的条带。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况 取处于对数生长期且状态良好的CAL-27细胞接种至六孔培养板中,待细胞完全贴壁后,换含有不同浓度TP(5、10、20 μg/L)的培养基作用不同时间(12、24、48 h)。收集培养基,并用无EDTA的胰酶消化细胞,终止后所得悬液与细胞原培养基以1 000 r/min的条件离心5 min,弃尽上清,以500 μL 1×Binding Buffer轻柔吹散细胞沉淀,每组样品中再分别避光加入5 μL Annexin V和5 μL PI染色液。混匀后,避光静置染色20 min,并在2 h内通过流式细胞仪(Invitrogen Attune CytPix,赛默飞,美国)完成所有检测并分析结果。

1.3 统计方法

2 结 果

2.1 TP对舌癌细胞的自噬诱导作用

经过TP(5 μg/L,24 h)处理的舌癌细胞出现明显的空泡现象,这是自噬的典型表现之一[4]。MDC染色发现TP处理过的细胞荧光强度明显增加,说明TP处理的细胞中有大量自噬泡的形成,TP可能诱导舌癌细胞发生了自噬(图1A)。进一步验证TP对舌癌细胞自噬的影响,分子水平Western Blot实验显示,随着TP作用时间(12、24、48 h)和作用浓度(5、10、20 μg/L, 24 h)的增加,自噬标志蛋白LC3、Atg3、Atg7表达均明显上调,与对照组相比具有显著性差异(图1B、C)。说明TP能够诱导舌癌细胞发生自噬,并且呈现时间和浓度依赖性。

图1 雷公藤甲素诱导TSCCs自噬Fig 1 Triptolide induces autophagy of TSCCs

2.2 TP对CAL-27细胞凋亡的影响

MTT实验发现TP对CAL-27细胞的杀伤作用呈现浓度依赖性,TP作用48 h对细胞的IC50为12.39 μg/L(图2A)。流式细胞术发现TP处理后的CAL-27细胞发生凋亡,随着TP作用时间(12、24、48 h)和作用浓度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,CAL-27的凋亡率不断增加,呈现时间和剂量依赖性(图2B)。随着TP作用时间(12、24、48 h)和作用浓度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,凋亡相关蛋白PARP和Caspase-9剪切体表达明显上调,与对照组有显著性差异(图2C～D)。以上结果充分说明,TP能够诱导口腔癌CAL-27细胞凋亡。

图2 雷公藤甲素诱导CAL-27细胞发生凋亡Fig 2 Triptolide induces apoptosis of CAL-27 cells

2.3 雷公藤甲素通过自噬诱导CAL-27细胞发生凋亡

自噬与凋亡均为细胞生命活动的重要调控机制,参与众多生理病理过程,二者的关系复杂,各自的调控通路之间发生交联,形成复杂调控网络,共同维持细胞内环境的动态平衡[8]。有文献报道[9]自噬与凋亡的关系可分为3 种:自噬与凋亡互不干涉,自噬诱导凋亡,自噬抑制凋亡。为进一步研究TP诱导的自噬与凋亡的关系,选择自噬抑制剂氯喹(CQ)以及巴伐洛霉素A1(BafA1)处理口腔癌CAL-27细胞,结果显示自噬抑制剂预处理细胞2 h后,能够减少TP(10 μg/L,24 h)诱导的细胞凋亡,与对照组相比,自噬抑制剂组细胞凋亡发生率显著下降(图2A),同时在分子水平得到了类似的结论,自噬抑制剂组凋亡蛋白PARP和Caspase-9剪切体表达明显下调,与对照组相比有显著性差异(图2B～C)。说明在口腔癌细胞中,雷公藤甲素通过自噬诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。

2.4 雷公藤甲素通过PIM1-STAT3信号通路诱导CAL-27细胞自噬

为了确定雷公藤甲素诱导口腔癌细胞发生自噬的机制,Western Blot实验检测STAT3-PIM-1信号通路相关蛋白表达情况,结果显示TP处理过的CAL-27细胞STAT3和PIM-1信号通路被抑制,随着TP作用时间(12、24、48 h)和作用浓度(5、10、20 μg/L,24 h)的增加,STAT3和PIM-1蛋白表达水平显著下调(图4A～B),呈现一定的时间和剂量依赖性。说明雷公藤甲素可能通过调控PIM1-STAT3信号通路,从而诱导CAL-27细胞发生自噬。

图4 雷公藤甲素通过PIM1-STAT3信号通路诱导CAL-27细胞自噬Fig 4 Triptolide induces autophagy of CAL-27 cells through PIM1-STAT3 signaling pathway

3 讨 论

自噬是哺乳动物细胞高度保守的细胞内能量代谢和细胞自我更新的机制,参与很多细胞生理病理过程,在机体稳态维持过程中发挥重要作用[10]。然而,异常的自噬激活可能会导致肿瘤细胞内某些蛋白质和细胞器的降解,而这些物质是肿瘤细胞存活不可或缺的,这种异常的自噬最终导致自噬性细胞死亡,因此自噬可能会成为新的肿瘤治疗的靶点,合理利用自噬能有效杀死肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的[11]。自噬所诱导的死亡属于II型程序性死亡[12],一般认为其具体机制与凋亡有关,有学者认为细胞自噬发生后进一步诱导凋亡从而引起细胞死亡,已有研究表明自噬和凋亡的调控信号通路在许多方面有相互交叉(crosstalk)[13]。本研究证实从雷公藤中提取的单体有效成分雷公藤甲素能够诱导口腔癌细胞发生自噬,进一步通过自噬抑制剂预处理细胞考察自噬与凋亡的关系,发现自噬位于凋亡上游,且自噬与凋亡有直接联系,抑制自噬能减少凋亡的发生,说明本论文体系中自噬与凋亡的关系是:自噬诱导凋亡,且自噬位于凋亡上游。

原癌基因PIM1作为蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶参与调控多个信号通路,在肿瘤的发生发展的多个过程中有重要作用。研究发现PIM1与信号转导和转录激活因子(STAT)家族存在相互调节关系[14]。而STAT3信号通路也是调控肿瘤细胞自噬的经典途径[15]。已有研究证实,缺氧刺激后微胶质细胞会通过STAT3信号通路激活细胞发生自噬性死亡[16],也有研究发现在人类成纤维细胞中,STAT3能够被IL-27调控,进而影响细胞自噬与凋亡[17]。这充分说明PIM1与STAT3在细胞自噬以及凋亡的发生过程中有着不可忽视的生物学作用,同时也有研究表明自噬很有可能成为口腔癌治疗的有效靶点,具有很大的临床开发潜力[18]。本研究发现雷公藤甲素处理人口腔癌细胞后,会抑制PIM1-STAT3信号通路,诱导肿瘤细胞发生自噬,进而诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。

综上所述,雷公藤甲素能够诱导口腔鳞状细胞癌细胞自噬,并进而诱导肿瘤细胞发生凋亡发挥抗肿瘤作用,在这一过程中细胞PIM1-STAT3信号通路被明显抑制。本研究证实了了雷公藤甲素诱导口腔鳞状细胞癌细胞自噬与凋亡的关系,并初步探讨了相关机制,为雷公藤甲素在临床上更广泛的使用提供了一定的理论基础。