CircRNA_TRMP7靶向调控NLRP3炎症小体在小鼠Ⅱ型糖尿病牙周组织炎症中的作用机制

沈想 王陈飞 张敏 梅幼敏

II型糖尿病是牙周病的主要诱发因素之一,而牙周病是成年人失牙的主要原因,也是诸多全身性疾病的重要危险因素,如何预防T2DM患者的牙周病的发生成为近年来关注的热点[1-3]。环状RNA(CircRNA)是一种非编码RNA,在糖尿病及其并发症的病理过程中起着重要的调控作用,并与牙周组织炎症密切相关[4-6]。NLRP3炎症小体是Nod 样受体家族中一类含有 pyrin 结构域的蛋白3功能复合体,已被发现在牙周组织炎症的发生中扮演着重要角色[7],但相关机制仍不明确,因此本研究初步探讨在T2DM环境下,BMDMs中circRNA_TRMP7对NLRP3炎症小体激活的调控作用,并检测分析相关炎症因子的表达,为T2DM牙周组织炎症的病因学研究及精准预防提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

人全血单个核细胞分离液(天津灝洋);DMEM高糖培养基(GIBCO公司,美国);胎牛血清(HYCLONE公司,美国);Murine M-CSF(Peprotech,美国);RNA提取试剂盒(上海生工);PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(大连TaKara公司);兔源NLRP3、Caspase-1 p20多克隆抗体(Abcam,美国);IL-1β、IL-18-Elisa试剂盒(Novus,美国);荧光分光光度仪(F-7000,日立,日本);基因PCR扩增仪(Mastercycle X50,Eppendorf公司,德国);实时荧光定量PCR系统(7300 Realtime PCR system,Applied Biosystems公司,美国);SDS-PAGE电泳仪(1645050,Bio-Rad公司,美国)。

1.2 人血PMBCs提取和全转录组测序

本研究选取2020 年1 月～2022 年1 月南通大学附属医院内分泌科16 例T2DM患者(年龄35～62 岁)作为实验组(根据《中国2型糖尿病防治指南》中的T2DM 诊断标准),选取南通大学附属医院体检中心21 例健康人作为对照组(年龄35～65 岁)。排除标准:(1)牙周病(根据2018 年牙周病国际新分类)及影响牙周病的其他系统性疾病(如艾滋病、风湿及肿瘤等);(2)吸烟史;(3)3 个月内有全身性抗菌药物、类固醇及非甾体类抗炎药物应用史。研究对象对所有治疗过程知情同意,并签署知情同意书。本研究获得南通大学附属医院伦理委员会批准(批号:2021-L088)。

提取外周血至分离液液面上,离心,吸取单个核细胞层与清洗液混匀,离心弃上清收集PBMCs。PBMCs去除核糖体RNA,片段化处理、建库、测序获得RNA序列信息。利用kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)数据库对差异的circRNA进行Pathway分析和超几何分布检验,寻找与差异circRNA可能相关的信号通路。

1.3 T2DM小鼠建模

随机选取4 周龄C57BL/6小鼠10只,对照组是非糖尿病的正常小鼠,以高脂饮食喂养4 周,STZ溶液(80 mg/kg)腹腔注射,高脂饮食喂养2 周,测血糖;成功标准:随机血糖值>16.7 mmol/L、多饮多食多尿,体重减轻。

1.4 BMDMs的极化诱导和siRNA干扰

取6～8 周C57BL/6小鼠胫骨和股骨骨髓,裂红细胞重悬,高糖培养液培养(含murine M-CSF)5 d,收集BMDMs。更换培养液(含50 ng/mL的LPS和10 ng/mL的IFN-γ)诱导24 h,收集M1型巨噬细胞。双链小分子RNA(siRNA,锐博生物科技有限公司)转染M1型巨噬细胞,抑制circRNA_TRMP7的表达。

1.5 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

提取细胞总RNA,测定浓度(纯度1.6～1.8),RNA逆转录,实时定量PCR扩增cDNA,2-ΔΔCT统计分析各组circRNA的表达(β-actin内参)。

1.6 免疫组化实验

提取小鼠下颌骨脱钙制片、封闭、一抗孵育过夜、二抗孵育、显色封片。每张切片随机选择不重叠的5 个视野(×40),Image J软件分析阳性着色区域的面积百分比,每组5 张不同切片,进行组间比较。

1.7 Western blot和ELISA检测

SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,转膜,封闭、洗涤,一抗孵育过夜,二抗孵育1 h,洗膜曝光成像。应用ELISA试剂盒和酶标仪(设定540 nm校正波长)检测各组细胞上清中的IL-18和IL-1β的浓度水平。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 CircRNA在人外周血单个核细胞中的表达

全转录组测序发现,较对照组实验组有38 个下调和36 个上调的circRNA(图1)。选取上调前10的circRNA进行RT-PCR验证,结果显示circRNA_2562(circRNA_TRMP7)差异表达最为明显,在放线菌素D作用下结构也较为稳定(图2)。通过KEGG分析发现circRNA_TRMP7可能参与NOD样受体相关的信号通路。

图1 CircRNA在PBMSs的差异性表达及生物信息学分析Fig 1 The differential expression of circRNA PBMSs and bioinformatic analysis

图2 结合全转录组测序筛选目标circRNAFig 2 Screening the targeted circRNA based on transcriptome sequencing

2.2 NLRP3炎症小体相关指标在小鼠牙周组织中的表达

免疫组化结果表明与对照组小鼠相比,NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白在T2DM小鼠的牙周组织中高表达(图3A～E),两组间具有统计学差异(P<0.05)(图3C～F)。

图3 小鼠牙周组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫组化染色结果Fig 3 Immunohistochemical staining results of NLRP3 and Caspase-1 in the periodontal tissue of mice

2.3 巨噬细胞中NLRP3炎症小体的表达

RT-PCR实验发现,与对照组小鼠相比在T2DM小鼠M1型巨噬细胞中Caspase-1、NLRP3的表达较高 (图4B～C);Elisa实验证实,T2DM小鼠的M1型巨噬细胞上清中的IL-1β和IL-18含量较多(P<0.05)。提示T2DM可能促进M1型巨噬细胞中的NLRP3炎症小体的激活(图4D～E)。

图4 Caspase-1、NLRP3在小鼠M1型巨噬细胞中的表达以及IL-1β、IL-18在细胞上清中的含量Fig 4 Expression of Caspase-1 and NLRP3 in M1 macrophages and the content of IL-1β and IL-18 in cell supernatant of the mice

2.4 干预circRNA_TRMP7的表达对NLRP3炎症小体激活的影响

应用siRNA-circRNA_TRMP7转染T2DM小鼠来源的M1型巨噬细胞,抑制circRNA_TRMP7的表达,通过Western-blot和Elisa实验证实siRNA可以减弱M1型巨噬细胞中Caspase-1和NLRP3的表达,降低细胞上清中IL-1β和IL-18的含量(P<0.05)(图5)。

3 讨 论

牙周病的发生发展严重影响患者的生活质量,同时也影响血糖控制,还可能诱发心血管疾病、肾病等其他并发症。然而,因为T2DM患者牙周病变的发生较为隐蔽,在临床上难以把握早期预防的时机[8-9]。2011年首次提出了“精准医学”的概念,作为其重要分支之一,口腔精准医学要求对口腔疾病发生的分子机制做深入研究,以实现对口腔疾病的“精准预防”[10]。而口腔精准预防的核心目标之一即是对“口腔亚健康”状态的检测[11-12]。因此,在T2DM环境下的牙周组织中探寻炎症的发生机制具有重要意义。巨噬细胞是牙周组织中的一种免疫细胞,T2DM会诱发巨噬细胞的激活,促进炎症因子的分泌,在牙周炎症发生的初始阶段至关重要[13-14]。由此提示巨噬细胞可能是精准预防T2DM牙周组织炎症发生的重要细胞之一。

circRNA是一种单链内源性的长链非编码RNA,具有共价闭环结构。大量研究表明,circRNA在不同疾病中可呈现特异性表达,并具有重要的调节功能。

有研究报道,在体外模拟牙周炎的细胞实验中,circRNAMAP3K11会促进牙周膜干细胞增殖并抑制其凋亡;circRNA在牙周组织的再生修复和炎症反应中起着重要的调控作用[15-17]。本研究也证实在T2DM患者外周血来源的PBMCs中,circRNA_TRMP7的表达明显增高。通过KEGG分析发现circRNA_TRMP7与NOD样受体相关信号通路密切相关,而NLRP3是该受体家族的重要成员之一,与炎症反应密切相关,从而提示circRNA_TRMP7可能参与T2DM牙周组织炎症的发生。

NLRP3炎症小体是由NLRP3识别受体蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和半胱天冬酶-1前体(pro-caspase-1)组成,广泛地存在于大量免疫细胞中。诱导炎症小体的激活和caspase-1的活化,会引发炎症因子IL-1β、IL-18的切割成熟和分泌[18-19]。有学者报道,在牙周炎患者牙周组织中,巨噬细胞内的NLRP3和IL-1β表达明显增高[20]。本研究发现在口内检查未发生牙周病的T2DM小鼠牙周组织中,NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18表达较高。体外实验也证实,NLRP3和Caspase-1在T2DM小鼠的M1型巨噬细胞中表达较高,细胞上清中的IL-1β和IL-18分泌较多。提示在小鼠口腔亚健康状态下,NLRP3炎症小体已被激活。通过siRNA干预证实,circRNA_TRMP7对NLRP3炎症小体激活具有正向调控作用。综上所述,circRNA_TRMP7和NLRP3炎症小体可能成为精准预防T2DM牙周组织炎症发生的生物标记物。