盐酸右美托咪定通过抑制细胞焦亡发挥脑缺血再灌注损伤保护作用

赵海峰，范鸣玥，陈 亮，秦 泽，李 红，杨素勉

（1.石家庄市第四医院麻醉科，河北 石家庄 050000；河北省人民医院 2.神经内科，3.眼科，河北 石家庄 050051）

治疗脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）的长期目标是减少脑缺血相关的神经元细胞死亡，目前已有一系列药物和介入疗法可以缓解CIRI 诱导的大脑神经元细胞凋亡［1］。氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和细胞焦亡等是CIRI 过程中重要的损伤机制［2］。目前临床上的药物治疗效果并不理想，研究CIRI发病机制及有效的治疗药物是当前急需解决的问题。

盐酸右美托咪定（dexmedetomidine hydrochloride，DEX）是一种高选择性的ɑ2肾上腺素受体激动剂，具有镇静、镇痛和抗焦虑作用，常作为镇静和麻醉剂，能有效缓解患者的烦躁和焦虑情绪［3］。有研究表明，DEX 对手术中颅脑损伤患者具有较好的镇静作用，对患者脑组织有一定的保护作用［4］。动物实验显示，DEX 可通过上调大鼠脑组织中微RNA-381 表达降低炎症反应，在大鼠CIRI 中发挥神经保护作用［5］。

细胞焦亡可通过多种途径参与缺血性脑卒中的发展过程，抑制细胞焦亡可减轻缺血性脑卒中引发的脑损伤［6］。GSDMD是gasdermins（GSDM）家族成员，为胱天蛋白酶1的底物，是细胞焦亡的执行者。GSDMD 的C 端和N 端均存在保守的结构域，其中N 端具有细胞毒性，可与脂质组分结合在细胞膜上形成孔洞。GSDMD 可被胱天蛋白酶1 切割成C 端和N 端，其N 端在细胞膜上寡聚化形成非选择性孔道，释放成熟的白细胞介素18（interleukin-18，IL-18）和IL-1β，诱导细胞焦亡的发生［7-8］。此外，细胞焦亡与NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎症小体通路相关［9］，其主要功能是激活胱天蛋白酶1前体形成胱天蛋白酶1，活化胱天蛋白酶1剪切IL-1β前体和IL-18 前体形成成熟的IL-1β 和IL-18，导致机体发生一系列炎症反应，从而导致CIRI［10］。细胞焦亡信号分子被认为是对缺血再灌注诱导的中枢神经系统功能损伤进行干预的靶点之一。本研究评估DEX对氧糖剥夺再复供（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）处理的PC12细胞及大脑中动脉阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）大鼠脑组织中焦亡相关蛋白GSDMD-N 段（GSDMD-N）、NLRP3和胱天蛋白酶1表达及IL-1β和IL-18水平的影响，探讨DEX减轻CIRI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和主要仪器

DEX（货号：SML0956），江苏星辰医药有限公司；PC12细胞，上海通派生物科技有限公司；IL-1β和IL-18 ELISA 试剂盒及胱天蛋白酶1 活性检测试剂盒（NEMC041.96），深圳欣博盛生物科技有限公司；兔抗大鼠NLRP3（ab263899）、胱天蛋白酶1（ab207802）、GSDMD-N（ab215203）和GAPDH（ab8245）单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体（ab6721），英国Abcam 公司；焦亡抑制剂VX-7652，武汉ABclonal 公司；DMEM 培养基和胎牛血清，美国Gibco 公司；1% Tritonx-100、RIPA裂解液、CCK-8 试剂盒、TTC 染液和BCA 蛋白定量试剂盒，上海碧云天生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒，南京建成生物工程研究所；凝胶电泳系统（型号：1658001），美国Bio-Rad 公司；CO2培养箱（型号：Forma™3）和酶标仪（型号：Multiskan SkyHigh），美国Thermo 公司；荧光显微镜（型号：IX71），日本Olympus 公司；LC-LX-HR165A 台式高速冷冻离心机，上海力辰科技有限公司。

1.2 细胞OGD/R模型构建和分组

PC12 细胞以无糖、无血清细胞培养液，于37 ℃，0.2% O2、5% CO2、95% N2条件下培养3 h，然后更换为含糖、含10%胎牛血清的细胞培养液，置 于37 ℃，5% CO2培养 箱 中 培 养24 h［11］制 备OGD/R 模型。①PC12 细胞分为细胞对照组、OGD/R 模型组、模型+DEX 2，5 和10 μmol·L-1组，给药组PC12细胞于OGD/R处理后给予DEX，置于培养箱中培养48 h 后进行后续实验。②PC12 细胞分为细胞对照组、OGD/R 模型组、模型+VX-765 2 μmol·L-1组 和 模型+VX-7652 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1组，给药组PC12细胞于OGD/R处理后给予VX-7652或同时给予VX-7652和DEX，置于培养箱中培养48 h后进行后续实验。每组3个复孔。

1.3 动物、模型制备、分组和样本制备

雄性SD 大鼠25只，体重180～230 g，SPF级，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK（苏）2021-0013。饲养于石家庄市第四医院实验动物部，将大鼠分为假手术组、MCAO/R模型组、模型+DEX 25，50，100 μg·kg-1组，每组5只。大鼠术前禁食24 h，模型组及模型+DEX 给药组大鼠采用线栓法制备MCAO/R 模型，ip 给予4%水合氯醛ip 麻醉大鼠后仰卧固定，切开皮肤暴露右侧颈动脉，在颈外动脉主干处剪一小口，将线栓由剪口部分缓慢向颅脑方向插入阻断大脑中动脉的血流供应，40 min后将线栓拔出完成再灌注。假手术组大鼠仅分离暴露血管，模型+DEX组大鼠在再灌注40 min后ip给予相应剂量DEX。模型组和假手术组ip给予等体积生理盐水。给药24 h后处死大鼠，取出完整脑组织。

1.4 CCK-8实验检测细胞存活率

取对数生长期细胞接种于96 孔板中，每孔3×103个细胞，按1.2 分组①方法分组。细胞孵育48 h 后，在各组细胞中添加10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃孵育2 h，用酶标仪测定450 nm 的吸光度（A450nm）值。以不含细胞只加试剂的孔作为空白对照孔进行调零，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=〔（实验组A450nm-空白对照组A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白对照组A450nm）〕×100%。

1.5 试剂盒检测PC12细胞培养上清液中LDH释放

取对数生长期细胞接种于96 孔板中，按1.2 分组①处理细胞。另设空白组（不接种细胞，作为试剂背景对照）和完全裂解组（只接种细胞，检测前30 min 加入10 μL 1% Tritonx-100 裂解液，以裂解细胞充分释放LDH）。细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h，收集细胞上清液，采用LDH 试剂盒在440 nm 测定溶液吸光度值（A440nm），计算LDH 释放率。LDH 释放率（%）=〔（实验组A440nm-空白组A440nm）/（完全裂解组A440nm-空白组A440nm）〕×100%。

1.6 免疫荧光染色法检测PC12 细胞中GSDMD-N染色阳性细胞比例

取对数生长期细胞接种于6孔板中，按1.2分组①处理细胞。OGD/R 处理细胞24 h 后，给药组加入DEX 2，5 和10 μmol·L-1，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h。PBS 洗涤2 次，用4%多聚甲醛固定细胞30 min；PBS 洗涤2 次，然后用含2%牛血清白蛋白和1%牛血清的PBS 室温孵育60 min，以阻断非特异性结合。加入抗GSDMD-N 抗体（1∶500）4 ℃孵育过夜。加DAPI染核15 min，用荧光显微镜观察。染色阳性细胞为表达GSDMD-N 蛋白（红色荧光）的细胞，计算单位面积下阳性染色细胞比例。

1.7 Western 印迹法检测PC12 细胞和大鼠脑组织中NLRP3、胱天蛋白酶1和GSDMD-N表达

收集并裂解1.2 分组①和②的细胞和1.3 大鼠脑组织，随后进行蛋白定量、上样、转膜、封闭，加入NLRP3、胱天蛋白酶1、GSDMD-N 和GAPDH 一抗稀释液（1∶1000）后于4 ℃孵育过夜。次日加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000）4 ℃孵育2 h。随后用凝胶成像仪对蛋白条带进行成像，并用Image J软件对条带进行积分吸光度扫描分析，以GAPDH蛋白为内参，用目标蛋白与内参蛋白条带积分吸光度值的比值反映目标蛋白的相对表达水平。

1.8 ELlSA 测定PC12 细胞培养上清液和大鼠脑组织中lL-1β和lL-18含量

收集1.2 分组①和②细胞培养上清液以及1.3分组的大鼠脑组织，按照试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm分别测定PC12细胞上清液和大鼠脑组织匀浆液吸光度值，根据标准曲线计算IL-1β和IL-18含量（ng·L-1）。

1.9 大鼠神经功能评分

1.3 分组大鼠，分别于给药后2 和24 h 采用Longa 神经功能评分法[12]评估各组大鼠的神经功能。0 分为无神经损伤症状，1分为提尾时病灶对侧前肢无法完全伸直，2 分为行走时出现向瘫痪侧转圈，3分为行走时向病灶对侧跌倒，4分为丧失意识、且无法自发行走。

1.10 脑梗死体积百分比测定

将1.3分组的大鼠断头取脑，剥离大脑于-20 ℃冰箱冷冻20 min后，立即作冠状位等距离连续切片（厚度2 mm），共切分为5片。用1%的TTC 染液在37 ℃水浴中避光染色30 min，加入4%多聚甲醛固定24 h。使用Image J 软件对切片进行扫描，分析梗死侧脑片非梗死区面积和正常侧脑片面积。梗死侧脑片的非梗死面积乘以脑片的厚度即梗死侧非梗死区大脑半球体积，正常侧脑片面积乘以脑片厚度即正常侧脑半球体积。脑梗死体积百分比（%）=（正常侧脑半球体积-梗死侧非梗死区大脑半球的体积）/正常侧大脑半球体积×100%。

1.11 比色法检测大鼠大脑皮质胱天蛋白酶1活性

1.3 分组的大鼠给药后24 h，断头取脑。分离出大脑皮质，根据大脑皮质质量加入生理盐水（大脑皮质∶生理盐水=1∶9），超声匀浆后离心收集上清液。按胱天蛋白酶1活性检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪在450 nm 测定溶液吸光度值，根据标准曲线计算各组大鼠大脑皮质胱天蛋白酶1活性（kU·g-1）［10］。

1.12 统计学分析

2 结果

2.1 DEX对OGD/R损伤PC12细胞存活率的影响

CCK-8 结果（图1）显示，与细胞对照组相比，OGD/R 模型组PC12 细胞存活率显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，模型+DEX 2，5和10 μmol·L-1组PC12细胞存活率均显著升高（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of dexmedetomidine hydrochloride（DEX）on proliferation of PC12 cells exposed to oxygen-glucose deprivation/reperfusion（OGD/R）by CCK-8 assay. PC12 cells were exposed to oxygen-glucose deprivation/reperfusion（OGD/R，model）before being placed in DMEM medium containing DEX（2，5，10 μmol·L-1）for 48 h. The cells were divided into cell control group，model group（OGD/R），model+DEX 2 μmol·L-1 group，model+DEX 5 μmol·L-1 group and model+DEX 10 μmol·L-1 group. Cell viability（%）=［（A450 nm of experimental group-A450 nm of blank control group）/（A450 nm of cell control group-A450 nm of blank control group）］×100%. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.2 DEX 对OGD/R 损伤PC12 细胞LDH 释放率的影响

与细胞对照组相比，模型组PC12 细胞LDH 释放率显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，模型+DEX 2，5 和10 μmol·L-1组PC12 细胞LDH 释放率显著降低（P＜0.05，P＜0.01，图2）。

Fig.2 Effect of DEX on lactate dehydrogenase（LDH）release of PC12 cells exposed to OGD/R. See Fig.1 for the cell treatment. LDH release rate（%）=［（A440 nm of experimental group-A440 nm of blank group）/（A440 nm of complete lysis group-A440 nm of blank group）］×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 DEX 对OGD/R 损 伤PC12 细胞GSDMD-N 蛋白表达的影响

免疫荧光染色结果（图3）显示，与细胞对照组相比，模型组GSDMD-N 蛋白阳性比例显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+DEX处理组PC12细胞GSDMD-N 蛋白阳性比例显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 DEX 对OGD/R 损伤PC12 细胞及MCAO/R 大鼠脑组织GSDMD-N、NLRP3、胱天蛋白酶1 蛋白表达的影响

2.4.1 PC12细胞

Western 印迹结果（图4）显示，与细胞对照组相比，模型组GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+DEX 组降低GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of DEX on GSDMD-N，NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3（NLRP3）and caspase 1 expressions in OGD/R-treated PC12 cells by Western blotting. See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A. IA：integrated absorbance. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Western 印迹结果（图5）显示，与模型组相比，模 型+VX-765 2 μmol·L-1组细 胞焦 亡相 关蛋 白GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 表达显著降低（P＜0.01），表明VX-765 可以抑制OGD/R 所致的PC12 细胞焦亡；与模型+VX-765 2 μmol·L-1组相比，模型+VX-765 2 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1组PC12 细胞GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表达无显著差异。

Fig.5 Effect of VX-765 combined with DEX on protein expressions of GSDMD-N，NLRP3 and caspase-1 in OGD/R-treated PC12 cells by Western blotting. PC12 cells were exposed to OGD/R before being placed in DMEM medium containing VX-765 2 μmol·L-1 or VX-765 2 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1 for 48 h. B was the semi-quantative result of A. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with model group.

2.4.2 大鼠脑组织

Western 印迹结果显示（图6），与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表达显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，模型+DEX 组GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1蛋白表达显著降低（P＜0.01），提示DEX 能够抑制细胞的焦亡，具有保护脑组织的作用。

Fig.6 Effect of DEX on protein expressions of GSDMD-N，NLRP3 and caspase 1 in brain tissue of rats after middle cerebral artery occlusion/reperfusion（MCAO/R）by Western blotting. The rats were divided into sham group，MCAO/R model group，model+DEX 25，50 and 100 μg·kg-1 group. DEX was administered by ip at 40 min after reperfusion.B was the semi-quantative result of A.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with sham group；##P＜0.01，compared with model group.

2.5 DEX 对OGD/R 损伤PC12 细胞培养上清液及MCAO/R大鼠脑组织lL-1β和lL-18水平的影响

2.5.1 PC12细胞

ELISA 检测结果显示，与细胞对照组相比，模型组细胞培养上清液中IL-1β和IL-18水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+DEX组IL-1β和IL-18水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01，表1），提示DEX能够抑制PC12细胞炎症反应。与细胞对照组相比，模型组IL-1β和IL-18水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+VX-765 2 μmol·L-1组细胞上清液中IL-1β和IL-18水平显著降低（P＜0.01，表2）；与模型+VX-765 2 μmol·L-1组相比，模型+VX-765 2 μmol·L-1+DEX 10 μmol·L-1组PC12 细胞培养上清液中IL-1β和IL-18 的水平无显著差异（表2）。上述结果提示，DEX 保护OGD/R 诱导的PC12 细胞损伤依赖于调控细胞焦亡。

Tab.1 Effect of DEX on interleukin-1β（lL-1β）and lL-18 levels in PC12 cell supernuant after OGD/R by ELlSA

Tab.2 Effect of VX-765 combined with DEX on lL-1β and lL-18 levels in supernuant of PC12 cells after OGD/R by ELlSA

2.5.2 大鼠脑组织

表3结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中IL-1β 和IL-18 水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，模型+DEX 给药组大鼠脑组织IL-1β 和IL-18的水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01），提示DEX能够抑制MCAO/R脑组织炎症反应的发生。

Tab.3 Effect of DEX on lL-1β and lL-18 levels in brain tissue of rats after MCAO/R by ELlSA

2.6 DEX对MCAO/R大鼠神经功能评分的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著升高（P＜0.01），说明CIRI能够造成大鼠的神经功能缺陷。与模型组比较，模型+DEX 给药组大鼠神经功能评分明显降低（P＜0.05，P＜0.01），说明DEX可缓解CIRI大鼠的神经功能缺陷（表4）。

Tab.4 Effect of DEX on neuromotor function of rats after MCAO/R

2.7 DEX对MCAO/R大鼠脑梗死体积的影响

TTC 染色结果（图7）显示，与假手术组相比，MCAO/R 模型组脑梗死体积百分比显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，模型+DEX 组脑梗死体积百分比显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.7 Effect of DEX on cerebral infraction volume of MCAO/R-treated rats by TTC staining. See Fig.6 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A. Percentage of cerebral infarction volume（%）=（volume of normal cerebral hemisphere-volume of non-infarcted cerebral hemisphere of infarction side）/volume of normal cerebral hemisphere×100%. ±s，n=5.＊＊P＜0.01， compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.8 DEX 对MCAO/R 大鼠大脑皮质中胱天蛋白酶1活性的影响

表5结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠大脑皮质胱天蛋白酶1 活性显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，模型+DEX 50和100 mg·kg-1组大鼠大脑皮质胱天蛋白酶1活性显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.5 Effect of DEX on caspase 1 activity in brain tissue of rats after MCAO/R

3 讨论

近年来，神经元焦亡已被证实参与中枢神经系统疾病的早期病理过程，包括创伤性脑损伤、CIRI和脊髓损伤［13］。早期研究表明，DEX 可以预防CIRI［5］。然而，DEX 对CIRI 神经细胞焦亡的作用尚不明确。在本研究中，利用体内MCAO/R 大鼠模型和体外OGD/R 诱导PC12 细胞损伤模型，证实OGD/R 损伤后PC12 细胞活力降低，细胞内焦亡相关蛋白GSDMD-N、NLRP3 和胱天蛋白酶1 蛋白表达增加，细胞培养上清液中炎症因子IL-1β 和IL-18水平明显升高；不同浓度DEX均可提高OGD/R后细胞存活率，降低焦亡相关蛋白表达和炎症因子水平。DEX 可部分降低大鼠脑梗死体积及神经功能行为学评分，降低缺血脑组织中焦亡相关蛋白的表达水平。上述结果共同提示DEX 通过抑制细胞焦亡发挥抗CIRI作用。

细胞焦亡属于胱天蛋白酶1 依赖性细胞死亡，是CIRI 的机制之一，通常是由GSDMD 介导的细胞炎性坏死，而激活GSDMD的正是NLRP3炎症小体通路中的胱天蛋白酶1［13］。本研究显示，OGD/R 可导致PC12细胞胱天蛋白酶1、IL-1β和IL-18大量释放，而DEX 可以降低胱天蛋白酶1 以及IL-1β 和IL-18 水平，抑制神经细胞焦亡。NLRP3 炎症小体能在脑缺血再灌注中活化，而活化的NLRP3炎症小体可促进炎症因子的释放，引起病理性炎症反应［14］。本研究发现，OGD/R 可激活NLRP3，进而活化胱天蛋白酶1 和GSDMD-N，诱导细胞焦亡。VX-765 是细胞焦亡抑制剂，VX-765 与DEX 联合用药结果显示，PC12 细胞用VX-765 处理后，DEX 对焦亡相关蛋白表达以及IL-1β 和IL-18 水平的抑制作用消失，进一步证实了DEX 能特异性抑制OGD/R 损伤后PC12细胞的焦亡。

此外，在大鼠MCAO/R 模型中，DEX 能改善MCAO/R 大鼠神经功能。模型组大鼠脑组织中胱天蛋白酶1、NLRP3 和GSDMD-N 蛋白表达、脑梗死体积及IL-1β 和IL-18 水平显著增加；DEX 能减少MCAO/R大鼠脑梗死体积，降低NLRP3、GSDMD-N和胱天蛋白酶1 蛋白表达，下调IL-1β和IL-18水平，降低胱天蛋白酶1活性，与体外实验结果一致。这些体内实验结果证实，DEX能够减弱脑组织细胞焦亡，改善大鼠CIRI损伤。

有研究表明，DEX 可通过抑制小胶质细胞焦亡发挥对缺血性脑损伤的保护作用［15］。除小胶质细胞外，星形胶质细胞和少突胶质细胞在脑缺血中也起重要作用［16］。有文献报道，DEX 能通过抑制星形胶质细胞的焦亡对脑损伤起到保护作用［17］。上述结果提示，DEX 在治疗脑缺血损伤过程中对小胶质细胞和星形胶质细胞均有调控作用，而本研究结果进一步提示，DEX 治疗脑缺血损伤的机制亦与抑制神经细胞焦亡有关。由于体内信号通路调控机制复杂且受多因素影响，未来需进一步深入研究DEX在缺血性脑损伤中的调控机制，并探讨DEX 在脑缺血损伤中对星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元和少突胶质细胞共同的药效靶点。

综上所述，DEX 对CIRI 具有保护作用，其机制可能与降低大脑皮质焦亡相关蛋白表达和减少炎症因子IL-1β 和IL-18 水平有关。本研究为临床治疗CIRI提供了理论依据。