醋酸铅暴露对PC12细胞凋亡与自噬的影响及可能机制

张 谊，王立晖，陈月芳，李永金，柳浦青

（1.南通大学附属丹阳医院，江苏省丹阳市人民医院，江苏 丹阳 212300；2.江苏大学医学院药理学教研室，江苏 镇江 212013；3.浙江中医药大学附属第二医院，浙江 杭州 310005）

铅是一种普遍存在于环境中的重金属。长期接触铅可使神经系统发生不可逆损伤，导致学习和记忆功能减退［1］。在模拟阿尔茨海默病研究中，抑制神经细胞凋亡可改善大鼠行为和认知功能［2］；而抑制自噬对小鼠神经元具有保护作用［3］，表明神经系统损伤过程中存在细胞凋亡与自噬。

沉默信息调节因子1（sirtuin1，Sirt1）是一种脱乙酰酶，可通过激活下游底物——叉头框蛋白转录因子3a（forkhead box O3a，FoxO3a）介导神经细胞的生成、凋亡与自噬［4-5］。重金属锰暴露可导致神经细胞中Sirt1 蛋白降解，促使FoxO3a 蛋白表达上调及乙酰化水平增加，诱导细胞损伤［6］。在H2O2诱导的神经毒性反应中，阻断Sirt1/FoxO3a 信号途径可抑制细胞促凋亡蛋白和自噬蛋白的表达，减轻神经细胞损伤［7］，表明Sirt1/FoxO3a 信号通路参与了细胞凋亡和自噬。本实验室前期研究发现，神经细胞的损伤伴随氧化应激与细胞凋亡［8］，但目前仍不清楚铅暴露是否可诱导神经细胞自噬。

本研究选用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12 细胞作为实验对象，建立醋酸铅〔Pb（Ac）2〕暴露细胞模型，探讨铅暴露对PC12 细胞凋亡与自噬的作用及其与Sirt1/FoxO3a信号通路之间的关系，为研究及预防铅神经毒性相关性疾病提供实验支持与理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和仪器

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12 细胞株，中国科学院上海细胞库。DMEM 培养基、胰蛋白酶、单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）试剂盒，美国Gibco公司；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；Pb（Ac）2，美国Sigma 公司；MTT，美国Amresco 公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒，碧云天生物技术研究所；吖啶橙/溴化乙锭（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）试剂盒，北京Solarbio 公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒，美国Molecular Probes 公司。兔抗人Sirt1、FoxO3a、叉头蛋白M1（forkhead box protein M1，FoxM1）和P62 蛋白多克隆抗体，美国ImmunoWay 公司；兔抗大鼠Bcl-2 相互作用蛋白1（Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin1）多克隆抗体，武汉ABclonal 公司；兔抗小鼠微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗体，美国Proteintech公司；小鼠抗人GAPDH 单克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗、山羊抗鼠IgG 二抗，美国GeneTex 公司；显影剂，美国Millipore 公司。其余试剂均为市售国产分析纯。

SW-CJ-2G 型超净台，苏州净化设备总厂；CO2细胞培养箱，上海Heal Force 公司；CKX53 型倒置显微镜，日本Olympus 公司；UPK-I-10T 型超纯水机，成都超纯科技有限公司；CP124S型电子分析天平，德国赛多利斯公司；680型酶标仪和1658001 型电泳仪，美国Bio-Rad公司；凝胶成像系统，南京麦高德生物科技公司；X1R 型冷冻离心机，美国Thermo Fisher 公司；Axio Scope A1 型荧光显微镜，德国Carl Zeiss公司；2400F超声波粉碎机，新芝生物科技公司；FACS CantoⅡ型流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 细胞培养和分组处理

PC12 细胞置高糖DMEM 培养基中，置于含5%的CO2和95%空气的37 ℃培养箱中孵育，取对数生长期细胞进行实验。细胞分为细胞对照组（空白培养基）和Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1组，给予Pb（Ac）2暴露24 h后，收集细胞进行实验。

1.3 MTT 法和比色法检测细胞存活率和细胞外液LDH含量

取对数生长期的PC12 细胞接种于96 孔板中，按1.2 分组处理后，弃去上清，每孔加入10 μL MTT 0.5 g·L-1，于37 ℃继续培养4 h 后弃去培养液，加入100 μL DMSO，振匀后于490 nm 处测定各孔吸光度（A490nm）值。细胞存活率（%）=（1-处理组A490nm/细胞对照组A490nm）×100%。

按照试剂盒说明书进行操作，收集1.2 分组细胞上清液，在波长450 nm 处检测各孔吸光度（A450nm）值，计算各组LDH含量。

1.4 AO/EB染色观察细胞凋亡

取对数生长期PC12 细胞接种于6 孔板中，按1.2 分组处理后，弃培养液并用PBS 洗涤2 次，在各孔加入2 mL 按比例配制好的AO/EB 混合染液，4 ℃避光反应10 min，将6 孔板置于荧光显微镜下，每组随机挑选10 个视野，观察各组细胞染色情况，核染色质呈橙红色荧光的为凋亡细胞。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率

取1.2 分组处理的细胞，用预冷的PBS 洗2 遍后加入400 μL 缓冲液，轻轻混匀细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 溶液，避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 MDC染色法观察细胞自噬

取对数生长期PC12 细胞接种于装有玻璃片的6 孔板中，按1.2 分组处理后，弃去培养基，用PBS洗涤，加入MDC 染料室温避光染色30 min。吸去染料后，加入4%多聚甲醛固定10 min，待玻璃片晾干后置于荧光显微镜下观察。自噬细胞出现绿色自噬空泡，以绿色荧光强度表示细胞自噬程度。

1.7 免疫荧光法检测细胞内Beclin1的表达

取1.2收集的细胞，用0.3% Triton X-100透化，羊血清封闭后，滴加抗Beclin-1 抗体（1∶300），4 ℃摇床反应过夜；用PBS 洗涤后加入山羊抗兔IgG二抗（1∶600），37 ℃避光反应1 h，甘油封片后置荧光显微镜下观察。当细胞自噬时，Beclin1蛋白呈点状聚集，以荧光强度反映Beclin1的表达水平。

1.8 Western 印迹法检测细胞Sirt1，FoxO3a，FoxM1，Beclin1，LC3和P62蛋白表达水平

取1.2 收集的细胞，加入裂解液裂解提取总蛋白，并用试剂盒测定蛋白浓度。总蛋白经电泳分离并转印至PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭，继而与一抗（Sirt1，FoxO3a，FoxM1，Beclin1，LC3 和P62 均1∶1000；GAPDH，1∶7000）于4 ℃摇床反应过夜。洗涤数次后，将膜和相应山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗（1∶5000）在室温下反应1 h，加入显影剂，在凝胶成像系统上进行扫描并拍照，Image J 软件分析各条带积分吸光度值。以目标蛋白与GAPDH 的积分吸光度值比值表示目标蛋白的相对表达量，LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ蛋白表达比值表示细胞自噬水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 Pb（Ac）2对PC12 细胞存活率和细胞外液LDH含量的影响

MTT 法检测结果如图1A所示，与细胞对照组相比，处理24 h 后，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1组PC12 细胞存活率均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。如图1B所示，Pb（Ac）2可引起PC12细胞外液LDH 含量增加。与细胞对照组相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1组细胞外液LDH 含量均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），表明Pb（Ac）2诱导PC12细胞损伤。

Fig.1 Effect of lead acetate（Pb（Ac）2）on cell viability（A）and lactate dehydrogenase（LDH）content（B）in extracellular fluid of PC12 cells by MTT and colorimetry. After exposure to Pb（Ac）2 0（cell control），100，200 and 400 μmol·L-1 at 37 ℃for 24 h，cell viability and LDH content in extracellular fluid were determined. Cell viability（%）=（1-A490 nm of treatment group/A490 nm of cell control group）×100%.±s，n=5.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 Pb（Ac）2对PC12细胞凋亡的影响

PC12 细胞经Pb（Ac）2处理24 h 后经AO/EB双染色，凋亡的细胞表现出AO/EB 染色双阳性，荧光叠加后呈现出均匀一致的橙红色圆形；而对照组细胞AO 染色均匀，且几乎无EB 染色阳性，表明无明显凋亡（图2）。

流式检测结果如图3 所示，与细胞对照组相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1组细胞凋亡率均显著升高（P＜0.01），表明Pb（Ac）2可诱导PC12细胞凋亡。

Fig.3 Effect of Pb（Ac）2 on apoptotic rate of PC12 cells detected by flow cytometry. See Fig.1 for the cell treatment. B was the quantitative result of A. ±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 Pb（Ac）2对PC12细胞自噬的影响

如图4A 所示，细胞对照组细胞几乎未见荧光和自噬泡，Pb（Ac）2100 μmol·L-1组细胞内荧光虽弱但自噬泡已开始出现，Pb（Ac）2200 μmol·L-1组MDC点状荧光信号显著增强，Pb（Ac）2400 μmol·L-1组细胞周围呈强烈绿色荧光，提示细胞内出现大量自噬空泡。定量结果（图4B）表明，与细胞对照组相比，Pb（Ac）2各浓度组荧光强度显著增强（P＜0.01），表明Pb（Ac）2染毒后PC12细胞自噬增强。

Fig.4 Effect of Pb（Ac）2 on autophagy of PC12 cells determined by monodansylcadaverine staining. See Fig.1 for the cell treatment. B was the quantitative result of A. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with cell control group. The arrows indicate autophagic bubbles.

2.4 Pb（Ac）2对PC12细胞Beclin1定位的影响

图5所示，细胞对照组Beclin1在细胞质微弱表达，Pb（Ac）2200 μmol·L-1组细胞细胞质中Beclin1表达明显增强，Pb（Ac）2400 μmol·L-1组细胞质内Beclin1 呈现大量点状聚集且荧光强度加强。表明细胞发生了明显自噬，细胞内自噬体数量增多。

Fig.5 Effect of Pb（Ac）2 on nucleic accumulation of Bcl-2 interacting coiled-coil protein（Beclin1）in the PC12 cells by immunofluorescence. See Fig.1 for the cell treatment. Arrows show the representative Beclin1 accumulation.

2.5 Pb（Ac）2对细胞自噬相关蛋白Sirt1，FoxO3a，FoxM1，Beclin1，LC3和P62表达的影响

Western 印迹法结果（图6）显示，与细胞对照组相比，Pb（Ac）2100，200 和400 μmol·L-1组细胞内Sirt1（P＜0.01）和FoxO3a蛋白（P＜0.05，P＜0.01）表达明显上调，同时自噬相关蛋白Beclin1 蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.01）也明显增加，P62 蛋白表达降低（P＜0.05，P＜0.01）；Pb（Ac）2200 和400 μmol·L-1组细胞FoxM1蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 讨论

本研究采用Pb（Ac）2暴露诱导PC12 细胞损伤模型，发现Pb（Ac）2可显著诱导细胞凋亡，且细胞内自噬程度明显增加，自噬相关蛋白表达显著增多，提示细胞自噬参与了Pb（Ac）2诱导的细胞凋亡过程。

自噬是一种细胞程序性死亡的机制，常由多种应激反应引起。大量研究表明，抑制细胞自噬可减少神经细胞的死亡，反之可促进细胞死亡［9-11］。本研究中，随着Pb（Ac）2浓度的增加，PC12 细胞内自噬泡增多，且Beclin1在PC12 细胞中的荧光强度明显增强，表明Pb（Ac）2促进PC12 细胞发生自噬。Beclin1，LC3 和P62 都是细胞自噬的重要标志物。其中，Beclin1 水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与自噬呈正相关，P62 蛋白表达水平与细胞自噬呈负相关［12-14］。本研究通过Western印记法检测Beclin1，LC3 和P62 蛋白的表达，发现Pb（Ac）2暴露诱导PC12 细胞自噬相关蛋白Beclin1 表达和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，P62蛋白表达降低，进一步证实细胞发生了自噬。

细胞自噬与凋亡之间存在交联，但两者的互作关系尚不明确［15］。有研究发现，抑制新生大鼠神经元自噬后，脑神经元凋亡增加［16］；另有研究发现，抑制大鼠海马体中神经元自噬后，大鼠脑损伤及神经元凋亡率明显降低［17］，表明细胞自噬与凋亡参与了细胞的死亡过程。本实验室前期研究也发现，用荧光染料Hoechst33342 对Pb（Ac）2处理的PC12 细胞染色后，显微镜下可观察到细胞核明显皱缩且蓝色荧光增强［18］，提示细胞出现了凋亡。本研究中，用AO/EB 染色后，随Pb（Ac）2浓度增加，细胞橙色荧光增强，绿色荧光逐渐减弱，表明细胞损伤中发生自噬的同时伴有细胞凋亡，同时，流式细胞检测结果表明，Pb（Ac）2可诱导细胞发生明显凋亡，与之前实验结果相一致。

Sirt1 在调节血管稳态、细胞自噬和凋亡中发挥重要作用［4］。FoxO3a是Sirt1 的下游靶基因，Sirt1可通过去乙酰化调节FoxO3a 的表达，参与调控细胞氧化应激、凋亡和增殖等过程［19］。而FoxM1 是FoxO3a 的下游基因，也是FoxO3a 的直接转录靶点，但关于FoxO3a 和FoxM1 的表达相关性报道不一［20-21］。本研究中，不同浓度Pb（Ac）2作用细胞后，可使细胞内Sirt1 和FoxO3a 蛋白表达明显上调，而FoxM1 表达下调，表明在PC12 细胞损伤的过程中可能有Sirt1/FoxO3a相关信号通路的参与，并存在FoxO3a负向调节下游效应基因FoxM1的可能。

综上所述，本研究发现Pb（Ac）2可显著诱导PC12细胞损伤，且细胞自噬及Sirt1/FoxO3a信号通路可能参与该损伤过程。在后续研究中，将使用自噬抑制剂加以干预，进一步证实细胞凋亡和自噬及Sirt1/FoxO3a信号通路在铅诱导PC12细胞损伤中确切机制。