一氧化氮与肺动脉高压及基于一氧化氮信号通路的肺动脉高压治疗药物研究进展

刘赛利，艾可龙，胡长平，2，3

（1.中南大学湘雅药学院药理学系，湖南 长沙 410078；2.长治医学院药学系，山西 长治 046000；3.心血管研究湖南省重点实验室，湖南 长沙 410078）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一种进行性肺血管疾病，当机体受到胶原血管病、先天性心脏病、门脉高压、艾滋病、药物和毒素等多种因素威胁时，会导致肺血管损伤，肺血管内皮功能发生障碍［1］，血管舒张因子如一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）产生减少，而血管收缩因子如血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）和内皮素1（endothelin-1，ET-1）产生增多，打破肺血管舒张和收缩平衡，导致肺动脉平滑肌细胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC）的异常增殖和早期内膜增生。在PH 发展进程中，肺动脉管腔逐渐变窄，肺动脉阻力逐渐变大；在疾病进展晚期，丛状病变和原位血栓形成使肺血管腔闭塞，右心后负荷增大导致右心肥大，之后出现右心衰竭最终导致死亡［2-3］。2018 年，世界肺动脉高压大会调整PH 的最新诊断标准为静息时平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）≥20 mmHg，肺动脉楔压≤15 mmHg，以及肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）＞2 WOOD单位［4］。

自1987 年发现内皮衍生松弛因子NO 后，这种无色无味的气体在人类生理和疾病研究中占据着越来越重要的地位［5-6］。NO 是一种自分泌和旁分泌信号分子，其功能包括松弛平滑肌、抑制血小板聚集、介导中枢和自主神经传递、裂解肿瘤细胞、杀灭细菌和刺激激素释放等［7-8］。本文概述NO 的来源、舒血管作用机制及其在PH 病理生理中的作用，和目前正在研究的针对PH 中NO 信号通路的靶向治疗药物，特别是纳米载体药物的研究进展。

1 NO的来源及其舒张血管作用机制

在血管壁中，NO 主要是在内皮细胞由L-精氨酸和分子氧经内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）催化合成［9］。NO 也可通过亚硝酸盐还原生成，这种不依赖NOS 的NO形成途径首次在缺血心肌组织中被发现，在酸性和低氧条件下更易发生，后来被证明有助于调节机体血液流动和血压［10］。生理条件下，NO 一经产生即迅速扩散到血管平滑肌细胞中，激活可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），催化GTP转化为第二信使环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），后者激活cGMP 依赖的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）使血管舒张，并抑制血管平滑肌细胞增殖和血小板聚集。肺血管平滑肌细胞中的磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDE），尤其是PDE5，通过水解将cGMP 转化为5-GMP 使其失活，从而呈现反调节功能［11-12］。PH 时超氧阴离子产生增多，导致eNOS 关键辅酶因子四氢生物蝶呤氧化，使eNOS 解偶联，NO 产生减少；且NO 会迅速与超氧阴离子反应形成过氧亚硝酸盐（peroxynitrite anion，ONOO-），其可与组织中酪氨酸结合，产生脂质过氧化作用和细胞毒性作用，导致细胞凋亡或坏死；且可引起PKG 硝化，NO 生物利用度降低，导致血管收缩和平滑肌细胞异常增殖［13-14］。

2 靶向NO/sGC/cGMP 信号通路治疗肺动脉高压的药物

目前针对NO/sGC/cGMP 信号通路的PH 靶向治疗药物主要有3种，分别是PDE5抑制剂、sGC 激动剂和吸入性NO。

2.1 PDE5抑制剂

迄今为止，成功增强NO/sGC/cGMP 信号通路的方法是使用PDE5抑制剂阻止细胞内cGMP水解代谢［15］。常用的PDE5抑制剂包括西地那非（sildenafil）、他达那非（tadalafil）和伐地那非（vardenafil）等。此类药物对肺循环血管床的扩张程度远大于体循环血管床。西地那非可抑制登山者肺血管平滑肌增殖和低氧性肺动脉压升高，亦能降低PH 患者PVR，减轻突然停止吸入NO后的反弹性PH。在安慰剂对照试验中，西地那非可改善PH 患者6 min步行距离，2005 年被美国FDA 批准用于治疗成人PH［16］。西地那非也被用于治疗新生儿、婴儿和儿童PH 以及多种心肺疾病相关的PH［17］。由于细胞内cGMP 是由NO 与sGC 中的血红素铁结合促进形成的，NO 缺失可导致cGMP 缺失［10］。理论上，PDE5 抑制剂会随着cGMP 合成减少而失效。因此，对于NO/sGC/cGMP 信号通路受损的PH 患者，其疗效可能有限。

2.2 sGC激动剂

sGC 是目前唯一已知的NO 受体，可被NO 激活催化GTP 转化为第二信使cGMP。在PH 患者肺动脉中，sGC 因NO 生物利用度降低、活性氧的产生、氧化应激引起的血红素-铁氧化导致的sGC 氧化以及相关的血红素组酶的丢失而功能降低［18］。由于PDE5 抑制剂治疗效果取决于基线NO 水平，而基线NO水平在PH患者中降低，因此直接作用于sGC 的治疗可能比PDE5 抑制剂对NO 通路受损的PH 患者疗效更好。利奥西呱（riociguat）是由拜耳公司研发的sGC 激动剂，可直接激活sGC，也能稳定NO-sGC 结合，从而上调第二信使cGMP，显著提高PH 患者的运动耐量，改善血流动力学参数和心功能［19-21］。利奥西呱已于2013 年10 月8 日获美国FDA批准用于治疗慢性血栓栓塞性PH［22］。

2.3 吸入性NO

吸入性NO 是一种选择性肺血管舒张剂，可在不影响心脏指数和全身血管阻力的情况下，显著降低mPAP 和PVR，提高动脉氧水平，降低体外膜式氧合需要，可通过气管插管、面罩持续吸入或脉冲鼻给药［23］。对于吸入性NO 治疗有效的PH 患者，突然停药时会出现PAP 和PVR 显著上升以及心排血量和血氧饱和度明显下降等反跳现象，部分患者症状轻，经吸氧等治疗后可缓解，重者可危及生命。造成这种反跳现象的原因可能与吸入NO 对内源性NO 合成减少和（或）ET-1 水平升高有关［24］。治疗时应缓慢逐渐停药，并根据血氧饱和度、血压和患者的症状调整停药速度。在持续给予NO 的过程中，NO 氧化产物二氧化氮（nitrogen dioxide，NO2）可在低浓度时积聚并引起气道亢进，高浓度时引起肺水肿；NO 可与血红蛋白结合生成亚硝酸血红蛋白，继而迅速氧化形成高铁血红蛋白，后者在循环中浓度过高可导致组织产生严重的低氧血症［21，24］。故其应用过程需严格控制NO 输送的浓度及速度，并实时监测毒性产物NO2的浓度。这需要一系列复杂的输送及监测设备，包括气瓶、压力调节器、监测仪和呼吸机等设备，以及训练有素的呼吸治疗师［25-26］；成本高、需实时监测且需负担笨重的气体处理设备，阻碍了吸入性NO 的广泛使用。目前，吸入性NO主要用于新生儿持续性PH及围手术期PH的治疗［21］。

3 NO供体的舒血管作用

吸入性NO 由于其输送的复杂性，其使用几乎仅限于PH 患者重症监护环境。NO 供体是外源性给药后在体内释放NO，补充内源性NO 不足，可为PH 日常治疗提供潜在可能性。代表性的NO 供体包括有机硝酸盐、金属亚硝基化合物、亚硝酸盐、N-重氮鎓二酸盐（NONOate）。

3.1 有机硝酸盐

有机硝酸盐，如硝酸甘油、硝酸异山梨酯和单硝酸异山梨酯，是具有硝酸酯（-O-NO2）基团的前药，在血管平滑肌细胞中经过线粒体的乙醛脱氢酶及内质网中的细胞色素P450 酶等系统进行代谢后释放NO［27］。该类药物存在较高的选择性，只有在静脉等乙醛脱氢酶含量丰富的血管平滑肌中才能释放NO，在大动脉中作用较差，在冠状动脉大血管中有一定作用，但在小动脉中则基本不释放NO。其短时间内即可快速起效，但连续用24 h 可产生耐药性，可应用于高血压危重症患者的抢救［28］。

3.2 金属亚硝基化合物

NO 是金属离子的强配体，在金属的配位域中占主导地位，NO 与金属离子结合形成金属亚硝基化合物，可作为NO 的供体。目前研究最多的金属亚硝基化合物是硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）［29］。SNP 是由1 个亚铁离子中心与5 个氰基基团和1 个亚硝基组成的无机盐，入血后可直接降解为亚硝酸盐，在血液中即可自发释放NO，无需进入平滑肌细胞代谢，其作用靶点无选择性，可引起全身性低血压，同时释放氰化物，故接受硝普钠治疗的患者必须监测氰化物中毒症状，如精神状态改变、癫痫发作和代谢性酸中毒等。SNP 作用迅速，降压作用强大，但半衰期很短，其效果在1～2 min内消失，目前主要应用于高血压危重症患者的抢救［30-31］。

3.3 亚硝酸盐

研究表明，血浆中硝酸盐和亚硝酸盐水平在PH 等内皮功能障碍疾病中较低［32］；亚硝酸盐和硝酸盐是NO 代谢的氧化产物，亚硝酸盐可以敏感地反映eNOS 活性的急性变化［33］。通过补充亚硝酸盐可以还原得到NO，调节血管内皮功能。吸入雾化的亚硝酸钠已被证明可以在脱氧血红素的亚硝酸盐还原酶作用下释放NO，产生选择性的、持续的肺血管舒张作用，改善低氧引起的动物和人类PH，其作用维持时间比吸入性NO 长，而血液高铁血红蛋白水平无显著升高［34-35］。亚硝酸盐和硝酸盐的血管舒张作用弱于有机硝酸盐（硝酸甘油）和金属亚硝基化合物（硝普钠），但不像有机硝酸盐产生快速耐受和显著的全身血管舒张作用［36］。

3.4 N-重氮鎓二酸盐

NONOate 是研究最广泛的NO 供体之一。NONOate 一般由仲胺与气态NO 在高压下反应合成，该方法可以合成从小分子到聚合物的各种壬酸盐，如二乙烯三胺/NO（DETA/NO）、精胺壬酸盐（SPER/NO）、脯氨酸壬酸盐（PROLI/NO）、丙胺丙胺壬酸盐（PAPA/NO）等［37］。NONOate不需要任何激活机制，在生理pH 下便可以通过水解自发释放NO［38］。研究发现，在PH 猪模型中，经NONOates气雾剂治疗后，可改善氧合并显著降低PVR，同时不引起显著的全身毒性［39］。然而，这种快速的NO释放作用时间短，且对特定器官、组织或细胞类型的选择性有限，限制了其在临床的潜在治疗应用。

4 NO 及其供体纳米递送系统对肺动脉高压的潜在治疗作用

为实现NO 持续、受控释放和靶点特异性，目前大量科研人员致力于开发新的载体系统递送NO 供体，为其应用于PH的日常给药治疗提供可能。

4.1 纳米粒子直接递送NO气体

Huang等［40］采用加压冷冻法将NO气体和氩气（Ar）包封于含磷脂和胆固醇的回声脂质体（echogenic liposomes，ELIP）中（NO/Ar-ELIP），可保护和输送NO 到靶组织，具有气体输送可视化和控制治疗性气体释放的潜力。Ar的加入可以防止NO与氧气反应生成NO2，并可通过调节其与NO 的比例从而调节NO 的释放速率，延长NO 在体内的释放时间。NO/Ar-ELIP 体外释放谱显示，脂质体释放NO 的速度较慢，可形成持续的释放谱。此外，NO/Ar-ELIP 能保护NO 不受血红蛋白等微环境清道夫的侵害，体外培养的大鼠PASMC 与NO/Ar-ELIP 孵育时，PASMC 摄取的NO 比给予游离NO 时增加7 倍，且未显示任何毒性。NO/Ar-ELIP 具有回声性，可增强超声造影成像，监测NO/Ar-ELIP 在体内的递送过程，且可通过使用高频率超声实现NO/Ar-ELIP 在特定组织可控释放NO。

4.2 基于亚硝酸盐的NO递送系统

Mohamed 等［41］开发了一种新型水凝胶状聚合物复合纳米颗粒用于递送NO，即以亚硝酸盐作为NO 供体，复合水凝胶型聚合物制成NO 释放纳米颗粒（NO-releasing nanoparticles，NO-RNP）。NO-RNP 的NO 释放动力学结果显示，其约在120 min 达到峰值，并持续释放8 h 以上，选择性地靶向低氧诱导的PH 小鼠肺动脉，并产生浓度依赖性的肺血管松弛作用，对内皮细胞的活性和炎症反应均无影响。

4.3 基于NONOate的NO递送系统

NONOate 具有较高的NO 负载能力，每摩尔NONOate 功能化分子可以释放2 摩尔NO。然而，NONOate 中NO 分子不受控制的自发释放限制了其临床应用潜力。为克服NONOate 中NO 的释放缺陷，研究者采用了几种策略，包括将NONOate 偶联到大分子支架中或物理封装到载体系统内。最近，Nahar 等［42］开发了一种长效NO 供体的肽修饰脂质体，即将DETA/NO 包封在经归位肽修饰的脂质体中。硫酸肝素是一种参与炎症过程的内源性物质，主要聚集在肺血管系统PH 病灶中，作为归位肽的配体，可引导DETA/NO 归位肽修饰的脂质体靶向肺血管并释放NO，引起肺血管特异性舒张，在不改变体循环血管压力的情况下可降低肺动脉压力。该脂质体半衰期为27 h，较长的半衰期可降低持续吸入的需求，并减少PH 反弹的发生率。以上研究表明，开发NO纳米递送系统对PH的药物治疗具有重大意义。

5 结语

NO 是调节肺血管功能的关键信号分子，其生物利用度降低可导致PH 的发生发展。目前针对NO 通路的特异性治疗药物对PH 患者的运动能力和肺血流动力学有一定的改善作用，但由于药物生物利用度低，靶向性差，不良反应多，患者的长期生存状况仍不理想。NO 供体普遍存在水中稳定性差、释放不受控、靶向性差等问题，限制了其对PH 的治疗应用。因此，为实现NO 持续、受控释放和靶点特异性，目前大量科研人员致力于开发新的载体系统递送NO 供体。迄今为止，通过将NO 供体与功能纳米材料结合作为载体，已经开发出了一些NO 释放纳米平台，体外和体内研究均表明，与游离NO 供体相比，NO 释放纳米平台可持续稳定地释放NO，选择性地靶向肺动脉，在PH 的日常给药治疗方面具有较大的应用潜力。然而，从纳米疗法的基础研究向临床试验转化的挑战仍有待解决，纳米载体对治疗药物的递送仍处于早期阶段，在实际应用中存在诸多不足，如纳米药物在粒径、稳定性、溶解度、药物释放和无菌性方面细微变化的可控和可重复制造仍然是一个挑战。同时，纳米药物在人体中的长期毒性和功效是否与动物模型的结果一致尚未得到证实。总之，需要进一步研究以优化纳米材料在PH中的应用。