丹栀逍遥散治疗乳腺癌的作用机制研究*

常 馨,卢 涛,黄金昶,3△

(1.北京中医药大学第三附属医院针灸微创肿瘤科,北京 100029;2.北京中医药大学生命科学学院,北京 100029;3.北京中医药大学针灸肿瘤研究所,北京 100029)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。据最新全球癌症负担数据显示,全世界新发乳腺癌226万例,首次超过肺癌,成为发病最多的癌种[1]。早期乳腺癌预后较好,中晚期乳腺癌仍面临严峻挑战[2]。近年来,我国乳腺癌发病率逐年上升,并呈年轻化趋势,5年生存率为83.2%,逐步向慢性病转变[3-5]。目前,乳腺癌治疗以外科手术切除为主[6],内科疗法包括放化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等,多学科综合治疗虽然提高了患者生存率,但肿瘤治疗所带来的不良反应亦不容小觑。

乳腺癌临床证型以肝郁气滞多见,疏肝解郁为基本治法,常用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散加减治疗。研究表明,逍遥散联合卡培他滨治疗晚期三阴性乳腺癌可明显提高抑瘤效果[7],进一步系统综述研究提出,逍遥散加减方联合化疗可提高乳腺癌患者实体瘤近期疗效有效率[8]。丹栀逍遥散出自《内科摘要》,是在逍遥散的基础上加清泻郁热的牡丹皮、栀子组成,全方具有疏肝清热、养血健脾的作用。乳腺癌随着病情进展,气郁化火,予丹栀逍遥散疏肝健脾清热,切中乳腺癌的基本机制[9]。此外,乳腺癌内分泌综合征临床表现、发病机制类似于围绝经期综合,严重影响患者生活质量,而丹栀逍遥散能有效改善乳腺癌患者相关内分泌症状[10]。本研究拟通过网络药理学筛选丹栀逍遥散有效成分,反向分子垂钓虚拟靶点,与开源数据库筛选的乳腺癌相关靶点匹配,获取丹栀逍遥散治疗乳腺癌的潜在作用靶点,分析上述靶点前的相互作用,富集分析相关信号通路,以预测丹栀逍遥散治疗乳腺癌的潜在作用机制,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

通过中药系统药理学数据库TCMSP平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID平台(http://www.megabionet.org/tcmid/),分别以当归、白芍、茯苓、白术、柴胡、牡丹皮、栀子、炙甘草为关键词,检索相关药物化合物,获取药物相关分子信息。通过口服生物利用度(oral bioavailability,OB)、类药性(drug-likeliss,DL)筛选药物活性成分,其中OB是指药物进入血液循环系统所占口服剂量的百分比,是关键的药代动力学参数;DL是影响分子的药代动力学并最终影响这些药物分子吸收、分布、代谢和排泄(ADME)的分子参数。由于缺乏相应的药理特性,中药配方中的大多数化合物无法到达特定细胞中的作用靶点,故本研究中认为OB≥30%且DL≥0.18的分子具有活性。

1.2 方法

1.2.1有效化合物及作用靶点

利用化学相似性寻找靶点,以TCMSP数据库中获取的丹栀逍遥散中药物活性化合物进行靶点垂钓,并将获取的靶点导入UniProt数据库(https://uniprot.org/)以得到靶点标准名称。

1.2.2疾病靶点

整合OMIM、geneCards、DrugBank数据库,获取乳腺癌的潜在治疗靶点,并将药物有效成分靶点与乳腺癌靶点匹配,选取重合靶点作为丹栀逍遥散治疗乳腺癌的相关靶点。

1.2.3有效化合物-作用靶点网络的建立

利用Cytoscape3.7.2软件建立丹栀逍遥散有效化合物-作用靶点网络,可视化丹栀逍遥散有效化合物和靶点信息的关系。其中有效化合物和作用靶点分别以“节点”表示,两节点之间作用以“边”表示。选取如下2项参数评估网络特征:(1)度(degree),为节点的连接数,反映单个节点与其他节点的互作频率,度值越大,节点在网络中的作用越重要;(2)中心度(betweenness centrality),为节点在路径中出现的频率,是反映节点重要性的指标,中心度越大,节点在网络中的作用越大。

1.2.4蛋白质交互作用(protein-protein interaction,PPI)网络的建立

PPI是组成生物分子网络的基本单位,也是疾病发生的关键步骤。本研究采用String数据库(https://string-db.org/)获取作用靶点之间的蛋白互作关系,探索丹栀逍遥散与乳腺癌的作用机制。使用系统默认参数,将物种设置为“homo sapiens”,并将数据导入Cytoscape3.7.2软件实现可视化。

1.2.5基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析

将筛选出的靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO分析和KEGG分析。选择物种为人(homo sapiens),筛选条件设置为:Count≥4,P≤0.01,错误发现率(false discovery rate,FDR)≤0.01,富集相应的生物过程富集和信号通路。

2 结 果

2.1 丹栀逍遥散有效化合物及作用靶点

从TCMSP、TCMID平台数据库中获得丹栀逍遥散全方每一味中草药的活性成分,依据口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、药物相似性(drug-like properties,DL)≥0.18的标准,筛选出活性成分45个(表1),药物相关作用靶点204个。

2.2 乳腺癌潜在靶点预测

通过OMIM、GenCards DrugBank数据库分别获得乳腺癌潜在靶点251个。

2.3 丹栀逍遥散治疗乳腺癌潜在作用靶点

将丹栀逍遥散有效药物靶点与乳腺癌靶点合并,取交集靶点,共得到44个交集靶点,作为丹栀逍遥散治疗乳腺癌潜在作用靶点。以45个丹栀逍遥散有效化合物和44个作用靶点,建立有效化合物-作用靶点网络,借助Cytoscape3.7.2软件可视化丹栀逍遥散有效化合物-作用靶点网络关系。丹栀逍遥散有效成分主要为槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、β-胡萝卜素、山柰酚,药物作用靶点包括前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、PTGS1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、胱天蛋白酶3(caspase 3,CASP3)、B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,BCL2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、Bcl2关联X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase 2,NOS2)、细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule1,ICAM1)、CASP8等。通过上述关键成分与靶点,构成丹栀逍遥散对乳腺癌的网络调控。

2.4 丹栀逍遥散有效化合物对应的作用靶点PPI网络分析

丹栀逍遥散有效化合物对应的作用靶点PPI网络,该网络共有44个节点、550条边,平均节点度为25,节点代表交集蛋白,边表示蛋白之间的相互作用,边的粗细代表蛋白间相互关联的强度大小。度值大于平均数的关键作用靶点共30个,按度值由高到低的前10位依次为白细胞介素(interleukin,IL)-6、丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activatedproteinkinase8,MAPK8)、CASP3、IL-10、MAPK1、CXCL8、ALB、CCL2、IL-1β、PTGS2,提示上述蛋白在PPI网络中发挥重要作用,可能为丹栀逍遥散治疗乳腺癌的核心作用靶点。

2.5 靶点通路分析

将上述44个靶点上传DAVID网站进行GO富集分析,共得到79个GO条目(P<0.05),采用P值和基因富集数量综合过滤,获取排名前20位的条目,丹栀逍遥散有效化合物的关键作用靶点富集明显的10个生物学功能为细胞因子受体及活性、受配体活性、磷酸盐、蛋白磷酸酶、G蛋白耦联受体、泛素蛋白连接酶、趋化因子受体、生长因子受体、趋化因子活性等,见图1。

图1 基因富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

获得具有明显意义的信号通路146条(P<0.05),采用P值和基因富集数量综合过滤,对其进行排序,获取排名前20位的条目,见图2。通路分析结果显示,富集程度高的通路为IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)、NOD样受体、Toll样受体、C型凝集素受体、缺氧诱导因子(HIF)-1、核因子(NF)-κB等。

图2 通路富集分析

3 讨 论

乳腺癌属于中医“乳岩”范畴,以乳房部无痛性肿块为主要临床表现,病位在乳房,与肝、脾、肾密切相关。《妇人大全良方》云:“若初起,内结小核,或如鳖、棋子,不赤不痛。积之岁月渐大,巉岩崩破如熟石榴,或内溃深洞,此属肝脾郁怒,气血亏损,名曰乳岩”。西医普遍认为乳腺癌的发生与内分泌失衡、晚婚晚育、不良饮食生活习惯、遗传等因素相关。早期乳腺癌预后较好,中晚期乳腺癌临床疗效有待进一步提高。本研究采用网络药理学和分子垂钓技术探究了丹栀逍遥散治疗乳腺癌的潜在治疗机制,构建并分析中药-活性成分-靶点网络,表明丹栀逍遥散治疗乳腺癌具有多成分、多靶点的网络调控特点。该网络的关键活性化合物为槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、β-胡萝卜素、山柰酚。5种化合物均属于黄酮类,具有类雌激素作用,其抗乳腺癌的机制主要为调节雌激素受体、抑制肿瘤细胞生成、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、增敏化疗、逆转耐药等[11-15]。

丹栀逍遥散治疗乳腺癌的PPI网络图直观反映了靶点间的相互作用,该网络以IL-6、MAPK8、CASP3、IL-10、MAPK1、CXCL8、ALB、CCL2、IL-1β、PTGS2为核心靶点,涉及的生物学过程包括细胞因子受体及活性、受配体活性、磷酸盐、蛋白磷酸酶、G蛋白耦联受体、泛素蛋白连接酶、趋化因子受体、生长因子受体、趋化因子活性等。其中,IL-6、IL-10为多效细胞因子,高水平IL-6、低水平IL-10与乳腺癌进展及不良预后相关[16-18]。IL-6上调可促进癌细胞生长、转移及肿瘤干细胞更新[18],IL-10下调可促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭与迁移,抑制癌细胞凋亡[19],靶向调控IL-6、IL-10极有可能是未来乳腺癌的潜在治疗模式。研究还表明,肿瘤微环境中骨髓来源的IL-1β通过诱导乳腺癌细胞NF-κB和CREB信号传导,导致自分泌Wnt信号传导和癌症干细胞集落形成,促进乳腺癌细胞发生骨转移,而阻断IL-1β介导的信号途径可抑制骨微环境癌症干细胞集落形成,从而减少骨转移[20]。MAPK8属于细丝裂原活化蛋白激酶家族,其功能涉及细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等各种机制。研究表明,MAPK8在乳腺癌中高表达,其信号通路通过磷酸化癌细胞核内的丝氨酸/苏氨酸位点,增强转录活性,诱导肿瘤细胞的恶性分化[21]。CASP3为级联凋亡通路中最重要的效应分子,与DNA断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。癌细胞分泌趋化因子、高表达趋化因子受体,刺激炎症反应促进肿瘤细胞增殖迁移,增加三阴性乳腺癌紫杉醇耐药,与乳腺癌不良预后密切相关[22]。CXCL8抑制剂或CXC趋化因子受体(CXC-chemokine receptor,CXCR)1/2抑制剂联合其他抗肿瘤治疗,可让乳腺癌患者临床获益,预测靶向干预CXCL8-CXCR1/2信号轴可能是有前景的乳腺癌治疗方法[23]。PTGS2高表达可能通过促血管形成、抑制免疫、影响细胞周期、增加细胞侵袭力等方式促进乳腺癌发生、发展及转移,与乳腺癌不良预后相关[24-25]。

丹栀逍遥散治疗乳腺癌的相关信号通路主要涉及IL-17、TNF、NOD样受体、Toll样受体、C型凝集素受体、HIF-1、NF-κB等,上述信号通路与细胞增殖、凋亡、免疫功能、耐药等密切相关。现有细胞实验表明,丹栀逍遥散含药血清干预后48 h,不仅可明显抑制乳腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡[26-27],上调自噬蛋白(Beclin1)表达以诱导乳腺癌细胞自噬[28],还能调控细胞能量代谢重编程[29]。动物活体实验提示,丹栀逍遥散低、中、高剂量均可不同程度地抑制MCF-7裸鼠移植瘤小鼠乳腺癌生长,促进肿瘤细胞凋亡,提示其抑瘤机制可能与促进癌细胞凋亡有关[30]。丹栀逍遥散能够下调乳腺癌移植瘤裸鼠肿瘤组织内缺氧诱导因子1α、IL-6、IL-8、单羧酸转运蛋白1、单羧酸转运蛋白4、赖氨酰氧化酶、血管内皮生长因子-A、血管内皮生长因子受体-2蛋白的表达。

本研究获得丹栀逍遥散治疗乳腺癌的潜在靶点44个,KEGG通路146条,提示其作用机制涉及多靶点、多通路的网络调节,可为以后研究丹栀逍遥散多靶点、系统性干预乳腺癌的具体机制及实验设计方案优化提供重要的理论依据。