广藿香精油纳米乳液的制备、表征及性能研究

尹玉洁，李 薇，万 欣，封嗣中，戎春驰

（南京师范大学食品与制药工程学院，江苏南京 210023）

广藿香精油（Patchouli essential oil，PEO）是从唇形科刺蕊草属植物广藿香植株中提取的一种植物精油，是一种具有壤香、木香和草药香的天然植物精油，主要的功能性成分是百里香酚、4-异丙基甲苯、γ-松油烯和香芹酚等物质[1]。此外，还含有多种萜类、酚类、酯类和醇类化合物等成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗菌活性[2]。然而，由于PEO 的味道有强烈刺激性、较强的挥发性和疏水性，还有对氧气和光的敏感性等各种缺点[3]，这些缺点严重限制了PEO在食品领域的广泛应用。

利用近些年来兴起的纳米乳液（Nanoemulsion，NE）技术来包埋精油，解决精油水溶性及稳定性差等缺点，精油NE 在食品的抗菌保鲜领域已经越来越多的应用[4]，逐渐成为食品保鲜领域的热点技术。NE是一种由油相、水相、表面活性剂等按照一定的比例制备而成的粒径范围为50～500 nm 的胶体分散系统[5]。大小均匀，透明或半透明[6]，具有高速离心稳定的性质，是动力学稳定体系之一[7]。与纯精油相比较而言，精油NE 的质地比较均匀、颗粒比较细腻、刺激性味道明显减弱，使用起来舒适感很强，在很长时间内都具有稳定性[8]。

国内外对NE 的制备主要采用高能乳化法和低能乳化法两种[9]。低能乳化法是NE 利用体系的内部化学能制备的，是由相变引起的。它包括相变温度、自发乳化和相反转合成过程[10]。这些过程主要依赖于油、表面活性剂和其他组分界面性质的变化，以此得到合适的配方[11]。如将肉桂[12]、迷迭香[13]和百里香酚[14]等天然植物精油制备成NE，再应用于新鲜蔬菜的保鲜。NE 粒径受油相[15]和表面活性剂的亲水亲油平衡值[16]（Hydrohile-ipohilie balance，HLB）的影响。陈良红[17]将木果油，吐温80 分别加热至70 ℃，在普通搅拌条件下将水相加入油相制备粗乳液，在500 r/min 转速下冷却至40 ℃，均质后冷却至室温，该法制备的体系稳定性很好。但是低能乳化法要考虑实验对象本身的理化性质，有一定的局限性。高能乳化法是通过机械装置利用高动能来制备NE。Kotta 等[18]是用高速搅拌机将油相、表面活性剂和水相混匀，然后在10000 psi 的压力下用高压均质机均质处理，使用UP200ST 超声波细胞破碎仪在100 W 功率下对粗乳液进行5 min 的超声处理，得到的NE 稳定性良好，在室温下贮藏较长时间都无分层现象。Adhavan 等[19]研究广藿香精油纳米乳液（Patchouli essential oil nanoemulsion，PEO NE）对福氏志贺菌、金黄色葡萄球菌、变形链球菌和白色念珠菌的抗菌和生物膜根除活性，发现PEO NE 有较强的抗念珠菌活性。Park 等[20]研究广藿香精油对长角血蜱若虫的驱避活性，发现PEO NE 提高了PEO 的驱避害虫能力，是一种潜在的长角海蛾驱避剂。Une等[21]研究了PEO 在三种不同温度下的保质期，探究了PEO 应用在香水市场的可能性。Manjeshk 等[22]研究了PEO NE 对二斑叶螨成虫和斜纹夜蛾幼虫的杀虫效果，发现斜纹夜蛾幼虫表现出相当大的拒食和觅食威慑作用。

鉴于目前对PEO 及PEO NE 的研究较少，本文采用高能乳化法制备广藿香精油纳米乳液PEO NE，通过荧光显微镜和扫描电子显微镜这两种仪器对PEO NE 的微观结构进行了研究，进一步分析比较了PEO NE 冻干样品的傅里叶红外光谱和X 衍射光谱。此外，还研究了PEO NE 的抗氧化活性和抑菌性能。该研究对基于小分子乳化剂的NE 的开发具有重要的指导意义，NE 作为一种极具前景的抗菌剂，可以提高营养物质的贮藏期和生物利用度，改善生物活性化合物的递送，可进一步开发在食品保鲜等方面中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

PEO（主要成分为藿香醇、广藿香烯，丁香酚、杜松烯） 江西华隆植物香料有限公司；壳聚糖（Chitosan，CTS，低分子量，脱乙酰度>90%）、焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate，TPP）、二氯甲烷（Dichloromethane，DCM）、乙酸、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、吐温80、甲醇、ABTS 和DPPH

上海麦克林生化科技有限公司；醋酸、氯化钠、乙醇、盐酸和氢氧化钠 中国上海国药集团化学试剂有限公司；实验中所有的水溶液 均用蒸馏水配制；2 株细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）和大肠杆菌（Escherichia coliATCC 8739）

均来自南京师范大学食品与制药工程学院；其他化学品 均为分析级。

CR21N 型高速离心机 Hinac；Secura 分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SM-3000C型超声波细胞破碎仪 南京舜玛仪器设备有限公司；752N/721/722N 型紫外可见分光光度计 济南欧莱博科学仪器有限公司；奥龙Aolong X 射线衍射仪（X-RAY XRD） 丹东奥龙射线仪器集团有限公司；DF-101S 型恒温水浴锅 湖南力辰仪器科技有限公司；高速剪切机 上海思峻机械设备有限公司；马尔文激光纳米粒度仪 Malvern Panalytical；CKX53 型奥林巴斯倒置荧光生物显微镜 上海巴玖实业有限公司；FEI Apreo 美国赛默飞扫描电镜 北京亿诚恒达科技有限公司；ALPHA II 型布鲁克傅立叶红外光谱仪 布鲁克（北京）科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 广藿香精油纳米乳液的制备过程 为了配制乳状液，根据陈莹莹等[23]的制备方法并进行改善。分别制备了油相和水相。在PEO 中加入二氯甲烷（1:3，v/v），搅拌至溶液溶解，即油相。将1 g CTS粉末分散到100 mL 1% w/v 醋酸溶液中，在室温条件下以1000 r/min 转速搅拌16～24 h 左右。为了清除未溶解掉的CTS 和其他的杂质，将得到的CTS 溶液进行4000 r/min 离心10 min 处理，取上清液用于后续实验。在乳化过程中，用蒸馏水将CTS 溶液稀释至所需浓度，并调节pH 至6.5，即水相。

采用高能乳化法制备PEO NE（图1）。将油相、乳化剂吐温80 和交联剂（TPP）缓慢加入CTS 溶液中，用高速剪切机在冰浴中以10000 r/min 的速度操作3 min，再磁力搅拌15 min 制备得到粗乳液。在剪切过程中，使用冰浴以避免加热效应。最后，通过超声波细胞破碎仪的作用，100 W，15 min，制备得到PEO NE，室温贮存。

图1 PEO NE 的制备Fig.1 Preparation of PEO NE

1.2.2 广藿香精油纳米乳液的表征

1.2.2.1 粒径、多分散性指数（Polydispersity index，PDI）、ζ电位 将新鲜制备的PEO NE 送到科学指南针公司进行测定；将广藿香精油纳米乳液在室温条件下贮藏30 d 后再次送到科学指南针公司进行测定。用马尔文激光粒度仪测定PEO NE 的粒径、ζ电位和PDI。样品在检测前稀释10 倍左右，马尔文激光粒度仪测量范围0.02～2000 μm，扫描速度：1000次/s[24]。

1.2.2.2 包封率 采用超滤离心法[25]测定PEO NE的包封率，连续测定35 d。首先用移液枪吸取400 μL样品放到超滤离心管中，将离心管置于离心机中，10000 r/min 转速下离心10 min，用移液枪吸取滤液，用无水乙醇定容至10 mL，通过紫外分光光度计来测定NE 的吸光度，根据标准曲线和稀释倍数关系计算出游离活性物的含量（Wf）。然后根据公式（1）计算PEO NE 的包封率:

式中：EE 为包封率，Wt为总活性物含量（mg），Wf为游离活性物的含量（mg）。

1.2.2.3 荧光显微镜 采用荧光显微镜测定乳液的微观结构，分别测定新鲜制备的PEO NE 和室温贮藏30 d 的PEO NE。在10×目镜和60×油镜下进行观测。用1 mg/mL 尼罗红溶液对精油染色，样品染色30 min 后进行观测。尼罗红溶液的激发波长是561 nm，发射波长是605 nm[26]。

1.2.2.4 扫描电子显微镜 为了用扫描电镜分析评价PEO NE 的形貌，把新鲜制备的样品在-40 ℃、真空0.007 大气压下冷冻干燥48 h。在5.0 kV 的加速电压下，用扫描电子显微镜（SEM）对其形貌和大小进行成像。粉状样品在检查前涂上一层金[27]。

1.2.2.5 傅里叶变换红外光谱 用傅立叶变换红外光谱仪检测新鲜制备的PEO NE 的结构变化。样品用溴化钾（1:100～1:200）在研钵中研磨成粉末。傅立叶变换红外光谱（FT-IR）的扫描范围为4000～500 cm-1[28]。

1.2.2.6 X 射线衍射 用X 射线衍射仪（Cu-Ka 辐射，波长0.154 nm）获得CTS 和新鲜制备的PEO NE的X 射线衍射图。所有扫描均在2θ=5°～40°范围内进行，扫描速度为2°/min[29]。

1.2.2.7 抗氧化活性 采用DPPH（2，2-二苯基-1-苦基肼）法和ABTS 法测定PEO NE 的抗氧化活性。根据邹小波等[30]的方法测定DPPH 自由基清除率。首先吸取0.2 mL PEO NE 与3 mL 的DPPH 混合均匀，并于避光条件下放置30 min。将3 mL 的DPPH甲醇溶液（150 μmol/L）与0.2 mL 甲醇溶液混合用作参照，测定517 nm 处的吸光度值，并按照以下公式计算DPPH 自由基清除率。

式中：Af为所测样品的吸光度；Ac为所测参照的吸光度。

根据史亚濛[31]的实验方法来测定ABTS+自由基清除率。将7 mmol/L 的ABTS+溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合，常温避光12 h 后得到ABTS+母液，并用超纯水稀释至其在734 nm 处吸光度值为0.700±0.020，获得ABTS+工作液。0.5 mL PEO NE（实验组）或超纯水（空白对照组）与6.0 mL ABTS+稀释液混合，30 ℃反应15 min 后在734 nm 处测定吸光度值。ABTS+自由基清除率的计算公式如下：

式中：A0表示空白对照组吸光度值，Ax表示实验组样品吸光度值。

1.2.2.8 抗菌活性 用抑菌圈直径（Mm）测定PEO NE 的抗菌活性，连续测定7 d。用剪刀将滤纸裁剪成直径为6 mm 的圆形滤纸片，然后将滤纸片分别浸染于PEO NE 中。待滤纸片完全浸染后将滤纸片置于已经涂布好菌株的培养皿中，设置三个平行。操作完成后，将培养皿置于37 ℃培养箱中进行培养，记录培养时间。然后在不同时间测量其抑菌圈大小，根据直径大小判定其抑菌性能[32]。

1.3 数据处理

数据是三次实验的平均值±标准偏差，数据处理软件是Excel，图形绘制软件是Origin。使用IBM SPSS Statistics 27 进行显著性差异分析。统计学差异采用单因素方差分析（ANOVA）和邓肯检验，差异有统计学意义（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 PEO NE 的特性——粒径、PDI 和ζ 电位

PEO NE 制备完成后，首先测定了新鲜制备的PEO NE 的粒径、ζ电位以及PDI。其次测定了置于室温下贮藏30 d 的PEO NE 的粒径、ζ电位以及PDI。如表1 所示，刚制备完成的PEO NE 的粒径是89.5 nm；室温下贮藏30 d 的PEO NE 的平均粒径达到了 160.8 nm。刚制备完成的 PEO NE 的ζ电位是20.8 mV；室温下贮藏 30 d 的 PEO NE 的ζ电位达到了 9.67 mV。样品的 PDI 值在 0.253 到 0.363 之间，这表明了PEO NE 是均匀分布的、单分散的、稳定的颗粒群。

表1 PEO NE 的粒径、PDI 和ζ 电位Table 1 Particle size, PDI and ζ potential of PEO NE

2.2 包封率

一般来说，包封率越高，载体的物理化学稳定性越高。Ruengdech 等[32]研究的儿茶素NE 的包封率为62%。李艺等[33]研究的茶黄素NE 的包封率为56.89%。本文经过超滤离心法测定了PEO NE 的包封率为95.85%，PEO 被包裹于载体中。如图2 所示，PEO NE 在30 d 内包封率依然保持在85%以上，表明PEO NE 的包封率稳定性非常好，原因可能是由于通过配方的改进，体系中含有大量的CTS，CTS 的粘度较大，阻碍了分子间的热运动，从而减小了被包裹的PEO 分子之间的聚集从而结晶析出的过程[34]；另一方面，CTS 与聚甘油类的乳化剂具有非常好的亲和性，巨大的亲水基团向外与CTS 结合，形成了紧密的乳化剂外壳，使PEO 难以从中泄露出来，从而提高了PEO NE 的包封稳定性[35]。

图2 PEO NE 的包封率变化Fig.2 Change of encapsulation efficiency of PEO NE

2.3 荧光显微镜

新鲜制备的 PEO NE 和室温贮藏 30 d 的 PEO NE 的荧光显微镜图如图3 所示。由图3 可见 PEO NE 在显微镜下呈现出非常微小、且分布均匀的小油滴，但是仍能观察到新鲜制备的 PEO NE 分布更加密集，并且 NE 的液滴尺寸较小，这与表1 中的数据是相对应的。通过对比新鲜制备的 PEO NE 和室温贮藏 30 d 的 PEO NE 的荧光显微镜图，可以发现，新鲜制备的 PEO NE 和室温贮藏 30 d 的 PEO NE 的油滴尺寸相差不大，乳液中油滴仍然是分布相对均匀的，表明 CTS 和吐温 80 共同乳化的 PEO NE 具有良好的稳定性。

图3 新鲜制备的PEO NE 和室温下贮藏30 d 的PEO NE 荧光显微镜图Fig.3 Fluorescence microscopy images of freshly prepared PEO NE and PEO NE stored at room temperature for 30 days

2.4 扫描电子显微镜

PEO NE 的 SEM 图如图4 所示。PEO NE 具有颗粒均匀的球形表面形态，这是因为 PEO 中的酚类物质可以与CTS 的酰胺基发生相关反应来形成共价键，从而增强PEO NE 的凝胶网络。与此同时，共价交联降低了在水中分散的PEO NE 的溶胀度，共价交联作用能够在冷冻干燥过程中保护PEO NE 的完整，从而能够维持PEO NE 的完整性[36]。

图4 PEO NE 的扫描电镜图Fig.4 SEM of PEO NE

2.5 傅里叶变换红外光谱

傅立叶变换红外光谱法（FT-IR）是确定纳米载体结构中各组分之间相互作用的一种很好的技术，可以分析关于有机和无机成分分子结构的基本信息，并提供从高空间分辨率（一般为10 μm）的生物样品中收集化学信息的独特可能性[37]。采用FT-IR 对冷冻干燥过的PEO NE 的化学结构进行了分析。如图5所示，PEO NE 与CTS 在3007、2923、2879、2856、1745、1708、1462 和1404 cm-1处出现不同的峰值。3000～3400 cm-1范围内的典型峰被认为是氢键，氢键和疏水力都有助于大分子结构的稳定性。研究发现，氢键附近疏水残基的存在通过形成脱水环境提高了后者的稳定性，从而保护蛋白质或多肽免受水侵蚀。3007 cm-1处的宽而强的谱带可以归因于广藿香醇单体之间通过O-H 键的分子间相互作用而产生的O-H 键的伸缩振动模式。不同的样品在2800～3000 cm-1范围内有多个峰，这可能是由于-CH3基团在不同位置的拉伸振动模式引起的[38]。2923、2879和2856 cm-1处的谱带与PEO 单体之间的C-H 伸缩振动有关。蛋白质二级结构主要特征是酰胺I 带，1600～1640 cm-1处的条带归属于β-折叠，1640～1650 cm-1处的条带对应于随机结构，1650～1660 cm-1处的条带表示α-螺旋结构，1660～1700 cm-1处的条带表示β-转角。1745 cm-1和1708 cm-1处的条带分别归因于PEO 中δ-愈创木烯的不对称和对称振动。1462 cm-1和1404 cm-1处出现了指定的峰，可能跟PEO NE 过程中添加的焦磷酸硫胺素有关[39]。

图5 傅里叶变换红外光谱图Fig.5 Fourier transform infrared spectrogram

2.6 X 射线衍射

图6 显示了CTS（A）的晶体结构、PEO NE（B）的晶体结构。CTS 的衍射光谱显示在20°的2θ处有一个尖峰，而PEO NE 的衍射图中峰值较小，这可能是由于其无定形，其结晶度较高[40]。并且乳化过程中TPP 的交联反应破坏了CTS 的晶体结构，这表明PEO 的加入可能导致CTS TPP 复合物结构的改变，从而导致PEO NE 的峰值较小。

图6 X 射线衍射图Fig.6 X-ray diffraction pattern

2.7 DPPH 和ABTS 抗氧化性实验

本研究通过DPPH 和ABTS 法对PEO NE 的抗氧化活性进行测定，其结果如图7 所示。DPPH和ABTS 实验结果均表明，与纯浓度的PEO 相比，PEO NE 具有更强的抗氧化能力，DPPH 自由基清除率达到69.64%，ABTS+自由基的清除能力可达到66.53%，PEO NE 的自由基清除能力得到增强，表明PEO 经过乳化作用，具有较好的抗氧化能力。NE对PEO 的保护作用更强，抗氧化性能更好。这是由于PEO 中强抗氧化组分百里香酚的成功负载。PEO强大的抗氧化活性归因于百里香酚结构中存在大量的酚基，其被认为是酚类物质抗氧化功能的活性位点[41]。已有研究报道酚基在姜黄素的抗氧化活性中起主要作用[42]。

图7 PEO、CTS、PEO NE 的抗氧化能力Fig.7 Antioxidant capacity of PEO, CTS, PEO NE

2.8 抑菌性能

在抑菌实验中，选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为本实验的实验菌种，在不同的时间段分别检测PEO NE 的抑菌性。如图8 所示，在 7 d 内 PEO 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈变化范围是11.9～14.3 mm，PEO NE 对金黄色葡萄球菌的抑菌圈变化范围是13.9～17.1 mm。在7 d 内PEO 对大肠杆菌的抑菌圈变化范围是5.6～8 mm，PEO NE 对大肠杆菌的抑菌圈变化范围是7.9～11 mm。由此可见，在相同含量的PEO 和PEO NE 以及其他外界因素一致的情况下，PEO NE 对2 种供试菌抑菌效果均比PEO 的抑菌效果好。这可能是因为NE 通过运输活性物质，PEO NE 在水中的溶解性和稳定性均明显提升，增加了分散性，提高了比表面积，并且可以与细菌细胞膜相互作用导致细胞裂解[43]。而且研究结果还表明PEO NE 对金黄色葡萄球的抑制效果要好于大肠杆菌。

图8 PEO NE 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的影响Fig.8 Impact of PEO nanoemulsion on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 结论

本文通过将PEO 制备成NE，对PEO NE 进行表征，还探究了PEO NE 的稳定性和抑菌性等性能。荧光显微镜和扫描电镜结果显示PEO NE 具有良好的稳定性；傅里叶变换红外光谱和X 射线衍射图谱分析PEO NE 的具体化学键变化。通过测定PEO NE 的 DPPH 和 ABTS 抗氧化活性，表明 PEO NE 具有良好的抗氧化稳定性；抑菌实验表明PEO NE 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑制效果。PEO NE 对革兰氏阳性菌的敏感性大于其他种类的菌株，可在后续深入研究NE 对革兰氏阳性菌的作用机制。NE 作为一种极具前景的抗菌剂，可以提高营养物质的贮藏期和生物利用度，改善生物活性化合物的递送，可进一步开发在食品保鲜等方面中的应用。