马鹿骨胶囊增加骨密度性能及安全性评价

冷京京，涂 伟，赵 璠，伊扬磊,*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西咸阳 712100；2.陕西华州医药生物工程有限公司，陕西西安 710054；3.西北农林科技大学动物科技学院，陕西咸阳 712100）

近年来骨关节炎（Osteoarthritis，OA）的发病率随着老年群体及肥胖人群的不断增加而随之攀升。由于被广泛应用于治疗骨关节炎的镇痛药和非甾体抗炎药长期使用会给人体带来一定副作用[1]，因此，从动物软骨及结缔组织中分离得到的硫酸软骨素由于具有抗炎[2-3]、抗凝血[4-5]、抗氧化[6]、抑制角质形成细胞增殖[7]、促进骨缺损愈合[8-9]等优良特性获得了极大的关注。硫酸软骨素是一种硫酸化糖胺聚糖，主要由N-乙酰-D-氨基半乳糖和葡糖醛酸重复连接而成[10]，能够诱导细胞分化，使其可用于成软骨和成骨构建体[9]，目前已被广泛用于治疗骨关节炎的营养保健品和药品中。

鹿骨是鹿科的骨架，作为一种中药成分，其富含大量蛋白质、胶原蛋白、软骨素、磷脂等成分，有助于促进胶原蛋白的合成、体内软骨成骨[11]，能够强健肌腱，缓解老年患者的关节疼痛、关节炎等症状[12]。郭晓琳等[13]研究发现了梅花鹿骨粉可以明显改善骨质疏松症；王旭东等[14]研究发现鹿骨可以改善骨质疏松症，明显增加骨小梁成分；有研究表明，鹿骨提取物可以改善小鼠绝经后的骨质疏松症症状，同时对小鼠肠道菌群也有促进作用[15]。

目前保健品的需求随着人们对自身健康的关注不断增加，功能性食品的安全性也逐渐成为人们关注的热点。目前对于硫酸软骨素和马鹿骨治疗骨关节炎等关节问题的作用已有报道，但二者复合使用的安全性及效果却鲜少阐明[12]。本试验根据《保健食品功能检验与评价方法（2022 年版）征求意见稿》[16]，研究以硫酸软骨素、马鹿骨、盐酸氨基葡萄糖为主要成分的马鹿骨胶囊对增加骨密度性能的影响及安全性评价，以期为增加骨密度相关的保健品及药品安全应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马鹿骨胶囊 自制，标志性成分及含量为：盐酸氨基葡萄糖（12 g/100 g）、硫酸软骨素（6 g/100 g）；胶囊的主要原料为盐酸氨基葡萄糖、马鹿骨、硫酸软骨素钠；用于细菌回复突变的菌株TA97、TA98、TA100、TA102 均购自上海北诺生物科技有限公司；叠氮化钠（NaN3）、1,8-二羟基蒽醌（Dan）、2-氨基芴（2-AF）

FIuka 公司；丝裂霉素C 浙江海正药业股份有限公司；碳酸钙 天津市致远化学试剂有限公司；实验样品均采用纯水配制和稀释。

SPF 级成年雌性 SD 大鼠 130 只，雄性 SD 大鼠30 只 四川省中医药科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（川）2013-19；200 只昆明种小鼠雌雄各半 北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0011，饲养于屏障级动物房，条件为温度20～26 ℃，湿度40%～70%。

AU480 全自动生化分析仪 Beckmen Coulter实验系统有限公司；Medonic M-series TD 全自动血液细胞分析仪 布尔医疗设备（北京）有限公司；小动物全自动高分辨率X 光机 Bruker In-Vivo DXS Pro公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验样品制备 洗净检验合格的马鹿骨首先进行脱脂处理，用3～6 倍量水煎煮2～5 次，每隔2 h换水一次，之后在55～60 ℃下进行干燥，粉碎后过100 目筛得到马鹿骨粉。将马鹿骨粉、盐酸氨基葡萄糖和硫酸软骨素钠混合30 min 得到混合粉，用70%乙醇制软材，16 目制粒，之后在55～60 ℃下进行干燥，14 目整粒获得颗粒和粉末，装入0 号明胶空心胶囊，0.4 g/粒，检验包装即得。

1.2.2 增加骨密度试验 大鼠随机分为六组：假手术组、模型对照组（卵巢切除模型）、高剂量碳酸钙组、马鹿骨胶囊三个剂量组，每组12 只。假手术组手术：腹腔麻醉后切除小肠系膜；模型对照组和马鹿骨胶囊三个剂量组手术：麻醉方法同上，摘除双侧卵巢后止血缝合。术后四天，假手术组和模型对照组用纯水灌胃；高剂量碳酸钙组口服192 mg/kg·bw 的碳酸钙（该剂量相当于马鹿骨胶囊高剂量组钙水平，马鹿骨胶囊样品中碳酸钙含量为6.4 g 钙/100 g 样品，高剂量组1200 mg/kg·bw 中，含钙为76.8 mg/kg·bw，换算成碳酸钙：192 mg/kg·bw）。马鹿骨胶囊分为三个剂量组，即200、400 和1200 mg/kg·bw 组（分别相当于马鹿骨胶囊人体摄入量40 mg/kg·bw 的5、10和30 倍）。所有动物均以10 mL/kg·bw 进行灌胃，持续90 d，每周根据体重调整灌胃量。实验结束后，取右侧股骨，于105 ℃烤至恒重后称量骨重。用小动物全自动高分辨率X 光机测定大鼠左股骨样品的骨密度（测定条件—exposure time：1 min；binning：none；KVP：45；X-RAY Fliter：0.8 mm；f-stop：2.51；FOV：120 mm; Focal Plane：20 mm）。采用原子吸收分光光度法测定右股骨骨钙含量[17]。

1.2.3 安全性毒理学评价试验

1.2.3.1 急性毒性试验 称取马鹿骨胶囊90 g，加纯水至240 mL，间隔4 h 按2 mL/100 g·bw 空腹灌胃2 次。根据大鼠最大耐受量判断马鹿骨胶囊的急性毒性[18]。

1.2.3.2 遗传毒性试验Ames 试验 用TA97、TA98、TA100 和TA102 菌株进行有无大鼠肝S9 的标准平皿掺入法试验。设五个马鹿骨胶囊剂量：8、40、200、1000 和5000 μg/皿，设自发对照、溶剂对照（纯水100 μL/皿）和阳性对照。不加S9 试验的阳性对照为0.2 μg/皿的2,4,7-三硝基-9-芴酮（TA97、TA98），1.5 μg/皿的叠氮化钠（TA100），0.5 μg/皿的丝裂霉素C（TA102）；加S9 试验的阳性对照为10 μg/皿的2-氨基芴（TA97、TA98、TA100）和50 μg/皿的1,8-二羟基蒽醌（TA102）。每个剂量平行三次[18]。

1.2.3.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 昆明种小鼠（体重25～30 g）随机分为5 组，每组10 只，雌雄各半，设2.5、5.0 和10.0 g/kg·bw 三个马鹿骨胶囊试验组，另设阴性对照（纯水）、阳性对照（环磷酰胺40 mg/kg·bw）组。灌胃后24 小时再次经口灌胃，6 小时处死动物制片。计数一千个嗜多染红细胞（PCE）和两百个红细胞中PCE 和成熟红细胞（NCE）所占数目，并计算比值[18]。

1.2.3.4 小鼠精子畸形试验 设2.5、5.0 和10.0 g/kg·bw三个马鹿骨胶囊试验组，另设阴性对照和阳性对照组。按2 mL/100 g·bw 经口灌胃5 d。30 d 后取双侧附睾制片，记录不同类型畸形精子数[18]。

1.2.3.5 大鼠4 周喂养试验 设对照组（基础饲料）和1.2、2.8 和4.0 g/kg·bw 三个马鹿骨胶囊剂量组。大鼠4 周自由进食和饮水，每天灌胃一次，每周测定大鼠体重、两次给食量和剩食量以及摄食量，4 周后处死动物（处死前禁食16 h），进行血清生化学及组织病理学检查[18]。

1.3 数据处理

使用PEMS 3.1 统计软件包，各组数据以“平均值±标准差”表示，使用SPSS 21.0 进行分析，试验均数比较使用方差分析，方差不齐采用秩和检验，骨密度实验中模型组和假手术组间的差异比较使用t检验。

2 结果与分析

2.1 马鹿骨胶囊增加骨密度评价结果

2.1.1 马鹿骨胶囊对大鼠体重的影响 对六组小鼠持续灌胃90 d，试验前（第1 d）、试验中（第45 d）、试验末（第90 d）各组小鼠体重如图1 所示，试验之前各组小鼠的体重无显著差异（P>0.05）；试验中期和试验后期，模型对照组体重均极显著高于假手术组（P<0.01），说明卵巢切除模型建立成功。马鹿骨胶囊三个剂量组的体重在试验第1 d 开始至试验90 d结束与模型对照组比较均无显著性差异（P>0.05），说明连续饲喂马鹿骨胶囊不会对小鼠体重产生显著影响。

图1 马鹿骨胶囊对大鼠体重的影响Fig.1 Effects of Malugu capsule on weight of rats

2.1.2 马鹿骨胶囊对大鼠骨密度含量的影响 连续灌胃90 d 后分别测定各组小鼠的右股骨骨重、左股骨骨密度和右股骨骨钙含量。由图2 可见，模型对照组的骨密度为0.6307 g/cm3，骨钙含量为236.073 mg/g，极显著低于假手术组骨密度0.6663 g/cm3，骨钙含量267.113 mg/g（P<0.01）。马鹿骨胶囊三个剂量组的骨重与骨钙含量与模型对照组比较无显著差异（P>0.05），马鹿骨胶囊三个剂量组的左股骨骨密度分别为0.6651 、0.6560、0.6605 g/cm3显著高于模型对照组0.6307 g/cm3（P<0.05），这与苏辉等[19]的研究结果一致。高剂量组与碳酸钙组比较无显著性差异（P>0.05）。马鹿骨胶囊三个剂量组的骨重、骨密度和骨钙含量之间却没有显著差异，可能是由于三个剂量组之间剂量差异过大导致。

图2 马鹿骨胶囊对大鼠骨重、骨密度及骨钙含量的影响Fig.2 Effects of Malugu capsule on bone weight, bone mineral density and bone calcium content in rats

2.2 马鹿骨胶囊安全性评价结果

2.2.1 大鼠急性毒性试验结果 15 g/kg·bw 剂量的马鹿骨胶囊灌胃后，14 d 内大鼠生长正常，行为敏捷，无死亡或不良反应，结果见表1。说明马鹿骨胶囊应属无毒级产品。

表1 大鼠急性毒性试验结果Table 1 Results of acute toxicity test in rats

2.2.2 遗传毒性试验 Ames 试验结果如表2 和表3所示，2 次测试中，无论体系是否存在S9 试验，自发对照组的回变菌落数均为正常值，而阳性对照组数值远高于自发对照组，呈阳性反应。马鹿骨胶囊各组的数值均小于2 倍数量的自发对照组的数值，呈阴性，表明S9 添加与否，马鹿骨胶囊均不会诱发菌株突变。

表2 第一次Ames 试验结果Table 2 Results of the first Ames test

表3 第二次Ames 试验结果Table 3 Results of the second Ames test

小鼠骨髓细胞微核试验结果如表4 所示，雄鼠和雌鼠的PCE/NCE 比值与阴性对照组比较均无显著性差异（P>0.05）。阳性对照组雌、雄动物的微核率分别为21.4%和21.0%，显著高于阴性对照组0.8%（P<0.05），试验各组的微核率相比阴性对照无明显差异（P>0.05），说明马鹿骨胶囊不会造成小鼠骨髓细胞的突变。

表4 小鼠骨髓细胞微核试验结果Table 4 Result of micronucleus test in mouse bone marrow cell

小鼠精子畸形试验如表5 所示，阳性对照组的精子畸形率为5.52%，阴性对照为2.22%，有明显差异（P<0.05），马鹿骨胶囊各组的精子畸形率分别为2.22%、2.06%、2.28%，相对阴性对照无显著性差异（P>0.05），表明马鹿骨胶囊对小鼠精子无致畸性作用。

表5 小鼠精子畸形试验结果Table 5 Results of sperm malformation test in mice

2.2.3 大鼠4 周喂养试验 30 d 喂养期间，大鼠健康状况良好，无中毒及非正常表现。当马鹿骨胶囊剂量为人体推荐摄入量100 倍时，没有对大鼠组织形态、器官等指标造成显著影响，表明马鹿骨胶囊的最大无作用剂量大于4.0 g/kg·bw。

马鹿骨胶囊对大鼠体重的影响如图3 所示，各剂量组的动物周体重与对照组比较均无显著性差异（P>0.05）。表明马鹿骨胶囊不会影响大鼠体重及食物利用率。综上所述，马鹿骨胶囊不会导致受试物身体的损害性改变。

图3 30 d 喂养试验雄鼠（A）和雌鼠（B）体重变化Fig.3 Changes in body weight of male (A) and female (B) rats during the 30 d feeding experiment

3 讨论与结论

本研究对马鹿骨胶囊的增加骨密度性能进行了评价。在成功建立切除卵巢模型的基础上，试验组的实验中期和末期体重与模型对照组比较均无显著性差异。试验各组的左股骨骨密度显著高于对照组。按照评价标准：马鹿骨胶囊具有增加骨密度功能。本研究同时对马鹿骨胶囊的安全性进行了评价。马鹿骨胶囊经急性经口毒性试验属无毒级别；遗传毒性试验表明马鹿骨胶囊不会导致骨髓细胞突变，不影响精子畸形率；连续30 d 喂养马鹿骨胶囊不会导致动物身体的异常变化。

马鹿骨胶囊所用原料盐酸氨基葡萄糖、马鹿骨、硫酸软骨素钠的安全性在长期研究中得到验证。盐酸氨基葡萄糖可以提高软骨细胞的修复能力，从而改善关节活动度，缓解疼痛[20]、提高免疫[21]。目前已有很多学者研究对于治疗骨关节疾病的药物复配的治疗情况，有研究表示骨痨愈康丸联合盐酸氨基葡萄糖能有效抑制炎性因子[22]；补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖能够促进软骨细胞中胶原蛋白的表达，降低软骨细胞的凋亡水平[23]。颜晨燕等[24]将鲨鱼软骨的硫酸软骨素和胶原蛋白复配，发现了该配方能改善骨关节炎，恢复关节软骨中流失的胶原蛋白。

近年来硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖用以改善骨关节性能的研究十分广泛[25-28]，但对于硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖与马鹿骨的复配研究却非常少。马鹿骨作为一种中药药材，传统上常将其用于防治各种骨关节疾病，认为其具有生髓、补髓，减缓骨髓老化，恢复骨髓年轻态的功效[29]。目前大多数马鹿骨研究集中在其成分分析和制备方法上，对其详细的功能和安全性评价的研究较少。研究表明，马鹿骨含有大量的人体所需的营养保健物质以及磷脂质、糖蛋白、维生素，多种矿物质元素如钙、镁、铁、锌、钾、铜等，鹿骨的软骨中还富含大量的酸性粘多糖及其衍生物，具有重要的生理功能和多种药理活性[30]。鹿骨中的胶原蛋白含量也较高，可作为功能性食品开发的重要原料[31]。马鹿骨胶能明显增强小鼠耐缺氧、抗疲劳、耐寒及耐高温能力，能增强正常和免疫抑制小鼠网状内皮系统的吞噬功能[32]。

鹿骨粉在临床上能够治疗继发性骨质疏松症，缓解患者临床骨痛的症状，提高患者的骨密度[33]。有报道显示，梅花鹿骨粉对去卵巢骨质疏松大鼠也表现出良好的治疗作用[13]。然而，以鹿骨粉与其它成分复配进行相关产品开发、功能测定和安全性评价的研究较少，曾有学者用鹿骨以及补骨脂等为主要成分研制了一种壮骨泡腾片，但是对其骨密度增强效果及安全性未做系统评价[34]。

本试验将具有预防和改善骨关节性能的盐酸氨基葡萄糖、马鹿骨、硫酸软骨素钠进行复配，研究其是否具有增加骨密度的作用，结果发现其对于增加大鼠骨密度具有良好作用，且安全性良好，无有毒或不良反应产生，本试验为马鹿骨作为保健品原料提供一定的理论依据，但马鹿骨和硫酸软骨素复配作用的具体机制还需要进一步研究论证。