通脉颗粒HPLC指纹图谱研究

【摘要】目的：初步建立通脈颗粒HPLC指纹图谱，为评价其质量提供依据。方法：通脉颗粒甲醇提取物的分析采用Diamonsil Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脱；体积流量0.5 mL/min；柱温40℃；检测波长313 nm。结果：12批通脉颗粒的指纹图谱相似度≥0.975，共标定出20个共有峰，指认2个共有峰（葛根素、阿魏酸）。结论：该方法操作简便、准确可靠、专属性强，重复性良好，可以用于通脉颗粒的质量控制。

【关键词】通脉颗粒；HPLC；指纹图谱；质量控制

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.06.028

【基金项目】吉林省发展和改革委员会产业技术研究与开发项目（2021C041-3）。

Study on the HPLC Fingerprint of Tongmai Granule

ZHANG Hao

（Liaoning Panjin Inspection and Testing Center， Panjin 124010， China）

Abstract： Objective：The research aims to establish HPLC fingerprint for Tongmai Granule，providing evidence for further assessment on its quality.Methods：The methanol extract of Tongmai Granule is analysed using Diamonsil Plus C18 chromatographic column （250 mm×4.6 mm，5μm）；with acetonitrile-0.1% phosphate acid as its mobile phase；volume flow 0.5 mL/min and temperature 40℃；eluted gradiently and tested under the wavelength of 313 nm.Results： The fingerprints of all 12 samples of Tongmai Granule share a similarity of at least 0.975，20 common peaks have been labelled with 2 of them identified （puerarin and ferulic acid）.Conclusion：The method adopted has turned out to be convenient、reliable、accurate、specific、and easily repeatable，which can be applied for the quality control of Tongmai Granule.

Key words： Tongmai Granule； HPLC； fingerprint； quality control

通脉颗粒系临床常用药，具有活血通脉之功效，用于缺血性心脑血管疾病、动脉硬化、脑血栓、脑缺血、冠心病、心绞痛等病症，处方由丹参、川芎、葛根三味药材组成[1]。在国内有50余家企业生产通脉颗粒，药品质量标准20余个。不同生产厂家依据不同药品质量标准生产的通脉颗粒存在着一定差异，从而影响通脉颗粒的临床疗效及应用。因此，建立全面合理的通脉颗粒质量评价方法，进一步规范其临床应用非常重要。

指纹图谱技术已被广泛应用于各种中药材和成方制剂的质量控制[2-12]。其中，HPLC指纹图谱技术是应用较多的一类，具有分析速度快、分离效果好、分析结果准确度高等优点[13-19]。部分通脉颗粒药品标准中仅对一种或两种化学成分进行了定量控制，中药的化学成分十分复杂，仅仅通过一种或几种化学成分的测定难以全面评价其质量。本实验建立了通脉颗粒HPLC指纹图谱，为全面地进行通脉颗粒的质量评价提供参考。

1.1仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DL-180超声清洗机（浙江石浦海天电子仪器厂）；XS-205DU电子天平（METTLER TOLEDO）；0.45μm滤膜（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2试药

葛根素（质量分数96.8%，批号110752-202217）、阿魏酸（质量分数99.4%，批号110773-201915）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯；水为纯净水。

本研究应用于HPLC指纹图谱分析的12批通脉颗粒样品分别选自4个生产企业，并且从每个通脉颗粒生产厂家中选取3个不同批号，样品来源信息见表1。

2.1色谱条件

Diamonsil Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱，0～20 min，10%～ 20%A；20～40 min，20%～40%A；40～45 min，40%～10%A；体积流量0.5 mL/min；柱温40℃；检测波长313 nm；进样量5μL。

2.2对照品溶液的制备

取葛根素、阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为48.12μg/mL、53.97μg/mL的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

取通脉颗粒，研细，取约2.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声40 min，放冷后补足失重，摇匀，滤过，即得。

2.4方法学考察

1）专属性。按“2.1”项色谱条件，分别取新鲜制备的供试品溶液和空白试剂（色谱级甲醇）进样，记录HPLC图，空白试剂不干扰供试品溶液的测定，表明专属性良好。

2）精密度。取通脉颗粒（厂家批号：D3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，记录HPLC图，以阿魏酸（13号峰）为内参比峰，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.23%～0.72%，相对峰面积的RSD为0.69%～1.89%，表明仪器的精密度良好。

3）稳定性。取通脉颗粒（厂家批号：D3），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下，室温下放置0、2、4、8、12、24 h進样，记录HPLC图，以阿魏酸（13号峰）为内参比峰，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.18%～0.67%，相对峰面积的RSD为0.96%～1.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

4）重复性。取通脉颗粒（厂家批号：D3）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样，记录HPLC图，以阿魏酸（13号峰）为内参比峰，各共有峰的相对保留时间的RSD为0.42%～0.89%，相对峰面积的RSD为0.96%～1.97%，表明本方法重复性良好。

2.5指纹图谱的建立及相似度评价

分别取所选取的12批通脉颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样，记录HPLC图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），设S1图谱为参照图谱，时间窗宽度为0.2，采用中位数法，进行色谱峰匹配，建立共有模式，标记了20个共有峰，得到12批通脉颗粒样品HPLC指纹图谱（S1-S12）及对照图谱（R）（见图1）。以生成的对照图谱为参照标准，12批通脉颗粒样品的相似度为0.975～ 0.995，相似度良好，结果见表2。说明所选取的通脉颗粒成分组成一致性良好，质量稳定。

2.6色谱峰的指认

选取的12批通脉颗粒样品的HPLC指纹图谱中，标定出了20个共有峰，并通过对照品比对指认2个共有峰，分别是6号峰葛根素、13号峰阿魏酸，供试品溶液（图2）和对照品溶液（图3）。

本实验首先考察了不同体积分数（25%、50%、75%、100%甲醇）的提取溶剂对通脉颗粒的提取效果，结果表明，采用体积分数100%的甲醇提取效果较好。色谱条件分别考察了不同的流动相（乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水）、不同检测波长（254 nm、280 nm、313 nm、350 nm）、不同柱温（30℃、35℃、40℃、45℃）及不同体积流量（0.5 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min）等条件，由于本实验研究的化学成分较多，各成分在不同条件下各有优劣，综合各方面因素加以分析和考虑，最终色谱条件采用乙腈-0.1%磷酸水为流动相、检测波长313 nm、柱温40℃、体积流量0.5 mL/min，所得到各成分色谱峰分离度高、峰型好、基线平稳。

通过指纹图谱得出，选取的12批通脉颗粒指纹图谱的相似度为0.975～0.995，相似度较高，且专属性、精密度、稳定性、重复性均较好，说明所建立的通脉颗粒HPLC指纹图谱分析方法稳定可靠，可操作性强。12批通脉颗粒中共有色谱峰的峰面积略有一些差别，表明不同厂家批次的通脉颗粒的成分含量有一定的差异和不同，需要更深一步研究。

【参考文献】

[1]鲁晓光，陈星，李军，等.HPLC同时测定通脉颗粒中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、阿魏酸和葛根素的含量[J].中国现代应用药学，2017，34（10）：1373-1376.

[2]刘晓凤，王姚，周思敏，等.川射干指纹图谱建立[J].中成药，2021，43（7）：1950-1955.

[3]侯常林，李凯，张芳，等.三叉神经散的UPLC指纹图谱研究[J].沈阳药科大学学报，2017，34（10）：883-888.

[4]於慧佳，董红阳，孙立新.尪痹片HPLC指纹图谱建立[J].中成药，2020，42（8）：2153-2155.

[5]李洋，陈健，张越，等.基于指纹图谱结合化学模式识别及多成分含量测定的白芍药材质量评价研究[J].中草药，2022，53（1）：231-237.

[6]赵宏苏，赵茹，乔金为，等.基于指纹图谱结合化学模式识别绿萼梅质量标志物的评价研究[J].中草药，2022，53（5）：1345-1353.

[7]杨天鸣，龚小霞，和顺芳.基于近红外全息指纹图谱分析的中药心可舒片质量评价新方法[J].化学与生物工程，2020，37（5）：65-68.

[8]谭金华，张炜，焦兴苹，等.异叶青兰HPLC-DAD指纹图谱的建立及其中4个成分的含量测定[J].中药材，2022，45（2）：401-404.

[9]彭小园，陈子月，崔兵，等.耳聋胶囊HPLC指纹图谱建立及5种成分测定[J].中成药，2022，44（3）：718-723.

[10]康璐，李钰洁，王曉，等.兴安升麻UPLC指纹图谱及4种酚酸类质量标志物测定[J].中成药，2022，44（2）：469-474.

[11]唐清，匡艳辉，李雯珊，等.基于指纹图谱和一测多评（QAMS）法的丹红化瘀口服液质量评价研究[J].中草药，2022，53（6）：1663-1670.

[12]刘紫璇，吴样明，蒋鑫铖，等.基于指纹图谱及一测多评法的芍药甘草汤物质基准质量评价研究[J].中南药学，2021，19（11）：2384-2389.

[13]刘妍妍，张慧文，白云霞，等.蒙药三子散HPLC指纹图谱结合化学模式识别研究[J].中国药房，2022，33（3）：319-325.

[14]刘佳，韩雪，王淼，等.舒通散指纹图谱研究[J].沈阳药科大学学报，2022，39（8）：938-943.

[15]曹淑丽，李玲，赵旻，等.基于HPLC法的加味四物汤指纹图谱研究[J].沈阳药科大学学报，2022，39（3）：262-268.

[16]李璐含，王丹阳，杨冰月，等.基于化学模式识别分析的黄芩HPLC指纹图谱研究[J].时珍国医国药，2022，33（1）：130-133.

[17]杨钊，高欢，周浩明，等.蓝布正HPLC指纹图谱建立及8种成分测定[J].中成药，2023，45（1）：123-126.

[18]廖禹程，丁一，张娟利，等.祛风止痛胶囊HPLC指纹图谱建立及7种成分同时测定[J].中成药，2022，44（10）：3111-3114.

[19]周娟娟，吴嫣艳，冯友龙，等.芩连胶囊HPLC指纹图谱研究及多指标成分定量分析[J].药物分析杂志，2022，42（2）：253-262.

【作者简介】

张浩，男，1987年出生，副主任中药师，硕士，研究方向为中药质量控制。

（编辑：侯睿琪）