沙棘林密度和丛枝菌根真菌接种对林下植物和土壤性状的影响*

王 晓 毕银丽,2 王 义 田 野 李 强 杜昕鹏 郭 芸

（1. 中国矿业大学（北京）煤炭精细勘探与智能开发全国重点实验室 北京 100083；2. 西安科技大学地质与环境学院 西安 710054；3. 神华神东煤炭集团有限公司 神木 719300）

我国是世界上最大的煤炭生产和消费国，90%以上的煤炭资源通过井工开采获得，开采的同时带来了一系列生态环境问题,亟待进行矿区生态修复。矿区生态恢复的首要任务是植被恢复，但采矿造成了大面积地表沉陷和植物根系拉伤，不利于沉陷区植被生长和恢复（毕银丽, 2017）。自然条件下，采煤沉陷区的植被恢复缓慢，种植人工林和添加微生物菌剂来促进采煤沉陷区生态恢复是目前国内外广泛运用的手段（毕银丽等, 2019）。

林下植物是森林生态系统的重要组分，在维持生态系统稳定性、生物多样性等方面发挥着重要作用（Carret al., 2011; 舒韦维等, 2021）。因此，林下植物恢复状况也就成为矿区植被修复的关键指标之一。调节林分密度是重要的经营手段，可以实现林下植物所需的水、土、光、热等资源的合理分配，最终影响林下植物状态（Fredericksenet al.,2013）。林分密度影响植物群落对资源环境的利用与分配，是人工林群落结构的数量指标（丁继伟等, 2018）。目前，有学者对不同林分密度下植物多样性和土壤理化性质进行了研究，发现合理林分密度能提高林下植物的生物多样性，改善土壤养分状况，促进人工林可持续发展（李婷婷等,2021）。

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一种重要的土壤微生物，能与80%以上的陆地植物形成共生关系（Smithet al., 2008）, 在生态修复中发挥着重要作用。研究表明，菌根共生体可扩大植物根系的养分吸收范围，增强植物抵御生物和非生物胁迫的能力，加速植物生长和植物群落的建成，提高采煤沉陷区土地复垦的效率（毕银丽等, 2020; 2021）。随着微生物工程的发展，将AMF 应用于田间试验探究其生态效应的研究已取得一定成效。研究表明，在我国西部采煤沉陷区，接种AMF 可提高土壤养分有效性、胞外酶活性，进而提高林下植物生物多样性，促进植物群落正向演替（毕银丽等, 2019）。虽然关于人工林密度和AMF 单独应用于生态修复的研究较多，但是较少研究两者交互作用对矿区生态修复的效应。

沙棘（Hippophae rhamnoides）是西部干旱半干旱区植被恢复的重要树种，在保持水土、防风固沙和固氮改土等方面有重要意义。研究表明，沙棘人工林的群落结构明显优于杨树和柳树林下植物的群落结构（郭连金等, 2005）。沙棘有很强根蘖能力，在风沙区尤为显著，需不断地平茬处理（范军波等, 2008）。种植密度是种植沙棘林需考虑的重要因素之一。

本研究选取种植9 年的沙棘人工林，分析接种AMF 以及不同种植密度对林下植物及土壤性状的影响，探究不同种植密度和接种丛枝菌根真菌（AMF）及其交互作用对我国干旱半干旱区采煤沉陷区生态修复的影响，筛选最优的人工生态修复方式。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于陕西省神木市大柳塔镇东山煤矿开采沉陷区国家水土保持示范园区（109°13′—110°67′E，38°50′—39°47′N）, 海拔1 200～1 300 m，处于黄土高原沟壑区向毛乌素沙漠的过渡地带。该地属典型干旱半干旱高原大陆性气候区，全年干旱少雨，年降水量410.3 mm，平均气温8.9 ℃，雨热同期，降水多集中在7—9 月。土壤类型以栗钙土为主，养分贫瘠。当地的先锋植物为一年生的草本植物狗尾草（Setaria viridis）和近一两年生草本植物猪毛蒿（Artemisia scoparia）。煤炭开采后，产生了大量的地裂缝和沉陷，植被和土壤退化。2012 年在该区域建立了一系列生态恢复和水土保持的生态工程，引入了多种人工灌木及AMF的应用。长期定位监测发现，人工林种植和接种AMF 促进了土壤养分提升，获得了一定的生态效益（王瑾等, 2014）。

1.2 样地设置与调查

样地为沙棘人工林，林龄为9 年，选择未人工干预的自然恢复区为对照，在当地沙棘果园种植密度（1 800～2 250 tree · hm-2）的基础上，考虑到采煤沉陷区土壤贫瘠、生态承载力低以及沙棘的根蘖能力强的特点，在人工修复区种植了当地密度（1 667 tree · hm-2）以及2 个更小密度（1 111 tree · hm-2, 835 tree · hm-2）的沙棘果园，来探讨最佳种植密度。在全面踏查该研究区后，采用典型样地法，在接菌区和对照区选取现有种植密度为1 667 tree · hm-2（高）、1 111 tree · hm-2（中）、835 tree · hm-2（低）的沙棘人工林，每个处理随机设置3 个20 m×20 m 的重复样地，共21 个样地。在2012 年沙棘林样地采用条带状种植方式，行距均为3 m，3 个密度的株距分别为2、3 、4 m。种植沙棘后，在沙棘的根部周围穴施50 g AMF 菌剂，种类为摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae）。菌剂由中国矿业大学（北京）微生物复垦实验室扩繁获得，孢子数为60 个 · g-1土 。每个样地的坡向、海拔、坡度等条件一致，总样地面积为8 400 m2。2020 年10 月中旬测定植物生长状况，每个样地沿对角线设置3 个灌木样方（5 m×5 m）、3 个草本样方（1 m×1 m）。灌木层记录种名、株高、冠幅及数量；草本层记录其种类、株高、数量及草本层盖度，将灌木幼苗计入草本层。2020 年10 月中旬取样调查土壤状况，在每个样地的对角线取5 个取样点，去除腐殖质层和地表枯落物后，用土钻取0～20 cm 表层土，混匀后装入自封袋带回实验室测定土壤的理化性质、微生物量等指标。草本植物生物量的测定采用全收获法，将植物地上部进行收获，80 ℃烘干后测定质量。

1.3 样品测定

土壤含水量用烘干法测定；土壤的pH 值和电导率用浸提-电导法测定；土壤的机械组成用激光粒度仪Mastersizer 3000 测定（魏静等, 2020）。土壤有机质用重铬酸钾水合加热法测定；土壤全氮用硫酸钾-硫酸铜-硫酸消化，凯氏定氮法测定；土壤全磷用硫酸-高氯酸消煮，ICP-AES 上机测定的方法测定；有效磷用(NH4)2CO3浸提，ICP-AES 测定；有效氮用CaCl2浸提，流动分析仪上机测定（鲍士旦, 2000）；土壤微生物量碳、氮、磷用氯仿熏蒸法测定（Jenkinsonet al., 2004; 吴金水等, 2006）；土壤菌丝密度用网格计数法测定（江飞焰，2019）；土壤孢子密度用湿筛-蔗糖差速离心法测定（Brundrettet al.,1996）；植物根系菌根侵染率用曲利苯蓝染色法测定（Smithet al., 1991）。

1.4 数据处理与分析

灌木层盖度（shrub coverage，SC）计算公式如下：

式中：SA 为灌木覆盖面积；TA 为土地面积。

重要值（important value，IV）表示物种在群落中的优势度指标，灌木和草本层的重要值计算公式如下：

式中：RA 为相对多度；RC 为相对盖度；RF 为相对频度。

测定植物多样性指数主要包括Shannon-Winner指数、Pielou 均匀度指数、Simpson 优势度指数，以及Margalef 丰富度指数，计算公式如下：

式中：H为 Shannon-Wiener 多样性指数；Pi为 第i种物种个体数占群落总个体数的比例（%）；J为 Pielou均匀度指数；H'为Simpson 优势度指数。其中R表示Margalef 丰富度指数；S为物种数目；N为所有物种的个体总数。

菌根侵染率、丛枝丰度等数据均小于1，故进行反正弦转换后再统计分析。所有数据均用SPSS 20.0进行正态性检验后进行后续分析。用SPSS 20.0 软件进行双因素方差分析（two-way ANOVA）和最小显著差异法（least significant difference， LSD）比较接种AMF 和不同种植密度对灌木生长指标（盖度、林下植物多样性、植被盖度、林下植物净初级生产力）、微生物量指标（碳、氮、磷含量）、AMF 特征（菌丝密度、孢子密度、菌根侵染率）的影响；用单因素方差分析（oneway ANOVA）和最小显著差异法比较种植密度和接种AMF 对上述灌木生长、微生物量、AMF 特征的影响，分析接菌与密度处理的差异；用单因素分析和最小显著差异法比较自然恢复区、对照区、接菌区各植物指标与土壤指标的差异；用Canoco 5.0 软件对林下植物群落进行主成分分析（principal components analysis，PCA），分析接种AMF 和种植密度对植物群落结构的影响；用R 语言的“vegan”程序包对林下植物群落进行聚类分析；用R 语言的“ggcor”程序包对土壤性状进行Pearson 相关性分析，并对植物群落性状与土壤及微生物性状运用“Mantel”检验，研究其相关性；用SPSS 20.0 软件进行主成分分析，对林下植物指标、土壤指标，计算评分值进行排序，用以综合评价修复效果。

2 结果分析

2.1 接种AMF 与不同种植密度的沙棘生长差异

不同种植密度和接种AMF 均显著影响沙棘林盖度和现有密度（P=0.000）（图1）。相同种植密度下，接菌可以显著提高沙棘林盖度与现有密度。在接菌和对照处理中，随着种植密度增大，沙棘林盖度与现有密度均显著增加。

2.2 接种AMF 与种植密度的林下植物生长差异

2.2.1 接种AMF 与种植密度对林下植物生物量和盖度的影响 接种AMF 与种植密度均显著影响沙棘林下植物地上部生物量（P＜0.05），种植密度显著改变沙棘林下植物的盖度（P＜0.05）。相同种植密度下，接菌区的林下植物生物量显著高于对照区。林下植物的盖度在接菌区和对照区无显著性差异。林下植物生物量在中等种植密度下最大，在高种植密度下最小（图2a）。随着种植密度的增加，林下植物盖度随着人工林种植密度的增加显著降低（图2b）。自然恢复区林下植物地上部生物量与植被盖度显著低于其他处理。

图2 不同接菌处理和种植密度林下植物地上生物量（a）和盖度（b）Fig. 2 Understory shoot biomass (a) and coverage (b) under different mycorrhizal treatments and planting density

2.2.2 接种AMF 与种植密度对林下植物多样性的影响 本次调查中共发现9 科18 属18 种植物，以禾本科、菊科、藜科为主。沙棘林下植物随着种植密度的增加，总物种数和一年生草本的物种数减少；中等种植密度下，林下植物的多年生物种数高于其他种植密度。人工复垦区的物种数均高于自然恢复区。

如图3 与表1 所示，接种AMF 与种植密度显著影响沙棘林下植物Pielou 均匀度指数与Simpson 优势度指数，且两者交互作用对林下植物的Pielou 均匀度指数具有显著影响（P=0.017）（表1）。随种植密度的增加，林下植物Pielou 均匀度指数显著增加，Simpson优势度指数显著降低；接菌区的Pielou 均匀度指数高于对照区，接菌区林下植物的Simpson 优势度显著低于对照区（图3）。人工复垦区的Shannon-Wiener 指数、Pielou 均匀度指数与Margalef 丰富度指数均显著高于自然恢复区，而Simpson 优势度指数显著低于自然恢复区（图3）。

表1 双因素结果分析表Tab. 1 The result of two-way ANOVA analysis

图3 林下植物的α 多样性指数Fig. 3 the α diversity indexes of understory vegetation

2.2.3 接种AMF 与种植密度对林下植物群落结构的影响 对林下植物群落进行主成分分析，PC1 解释了植物群落变化的38.9%，PC2 解释了植物群落变化的18.11%（图4a）。接种AMF（F=2.648，P=0.028）与种植密度（F=7.110，P＜0.001）均显著改变林下植物群落组成。低种植密度中对照区占据优势木本植物为芹叶铁线莲（Clematis aethusifolia），草本植物为多年生本氏针茅（Stipa capillata）、糙隐子草（Cleistogenes squarrosa）、沙鞭（Psammochloa villosa）及一年生草本植物猪毛菜（Salsola collina）和狗尾草；中等种植密度中对照区占据优势地位的木本植物为沙棘，草本植物为沙鞭、猪毛菜和狗尾草；在高种植密度下，对照区占据优势地位的植物为草本植物，而接菌区的优势木本植物为芹叶铁线莲、沙棘，草本植物为本氏针茅、猪毛菜和狗尾草。自然恢复区优势物种为多年生半灌木油蒿（Artemisia ordosica）、一年生草本植物刺穗藜（Dysphania aristata）与狗尾草，群落结构单一，多为一年生植物。聚类分析结果显示，接菌区的植物群落与对照区低种植密度和中等种植密度下的植物群落相似，对照区高种植密度林下植物的群落与自然恢复区群落相似（图4b）。

图4 林下植物群落主成分分析（a）和聚类分析（b）

2.3 接种AMF 与种植密度的土壤理化性质和微生物性状差异

2.3.1 接种AMF 与种植密度对土壤理化性质的影响不同接菌和种植密度处理的土壤理化性质存在差异（表2）。接菌区的土壤pH 值显著高于对照区且土壤的pH 均随着种植密度的增加而逐渐增大。接菌区与对照区的土壤电导率和机械组成无显著性差异，中等种植密度的土壤电导率值最高。低种植密度土壤黏粒含量和粉粒含量显著低于其他种植密度。接菌与种植密度对表层土壤含水量和土壤有机质含量无显著影响。接菌和种植密度显著影响土壤的全氮含量，中等种植密度土壤全氮含量最高。接种AMF 显著提高了土壤中的全磷和有效磷含量；高种植密度土壤全磷含量最高，有效磷含量最低。自然恢复区土壤pH 值、电导率值、黏粒、粉粒、有机质、全氮含量均低于人工复垦区，砂粒含量和有效磷含量显著高于人工复垦区。

表2 不同接菌处理和种植密度的表层土壤理化性质（均值±标准差）①Tab. 2 the physicochemical properties of understory topsoil in different mycorrhizal and planting density

2.3.2 接种AMF 与种植密度对土壤微生物性状的影响 接种AMF 显著提高了土壤的菌丝密度和孢子密度（图5）。在对照区，随着种植密度的增加，土壤中的菌丝密度和孢子密度显著增加。在接菌区，种植密度对土壤中的菌丝密度和孢子密度无显著性影响。接种AMF 显著提高了沙棘根系菌根侵染率、侵染强度和丛枝丰度（表3）。在对照区，随着种植密度的增加，沙棘根系侵染频度、侵染强度和丛枝丰度均逐渐增加。在接菌区，随着种植密度的增加，侵染强度和丛枝丰度显著增加，侵染频度无显著性变化。中等沙棘人工林种植密度下，土壤的微生物量碳含量显著高于其他种植密度（图5c）。不同接菌处理和种植密度均会显著影响人工林下土壤微生物量氮的含量；接菌区土壤微生物量氮含量总体上显著高于对照区；中等种植密度下，土壤的微生物量氮含量均显著高于其他种植密度（图5d）。接菌处理和不同种植密度对沙棘林下土壤的微生物量磷含量均无显著影响，在接菌区中等种植密度的沙棘人工林下微生物量磷的含量最高，约为2.5 mg·kg-1（图5e）。自然恢复区土壤中的AMF 的生物量与微生物量碳氮磷含量均低于人工复垦区。

表3 不同接菌和种植密度处理下沙棘根系菌根侵染情况①Tab. 3 The root colonization of Hippophae rhamnoides in different mycorrhizal and planting density treatment

图5 土壤菌丝密度（a）、孢子密度（b）以及土壤微生物量碳（c）、氮（d）、磷（e）Fig. 5 the soil hyphal length density（a），spore number （b）and the soil microbial biomass carbon (c), nitrogen（d）and phosphorus (e)

2.4 林下植物群落与环境因子的关系

对植物群落的多样性、盖度、生物量以及群落结构矩阵与环境因子矩阵进行mantel 分析（图6）。结果表明，土壤酸碱度、机械组成、有机碳、有效磷、沙棘林盖度、沙棘数量、菌丝密度、孢子密度与林下植物多样性、林下植物生物量、林下植物盖度具有显著正相关关系；电导率、全氮与林下植物多样性、林下植物生物量、林下植物盖度及林下植物群落结构具有显著正相关关系；微生物量碳与林下植物群落结构显著相关，微生物氮与林下植物多样性及林下植物群落结构具有显著正相关关系。对土壤、沙棘林的性状进行Pearson 相关性分析，结果表明土壤的微生物量碳、氮、磷以及AMF 生物量均与土壤理化性状以及人工林沙棘生长状况具有显著的相关关系。以上结果表明，人工林生长状况、林下植物群落、土壤理化性质及土壤微生物之间具有一定的联动效应和反馈机制。

图6 林下植物与土壤性状之间的mantel 检验Fig. 6 the Mantel’s test between understory vegetation and soil properties

2.5 接种AMF 与种植密度和土壤改良效应的主成分分析

为了综合评价不同接菌处理与种植密度对采煤沉陷区生态修复的效应，探究最优的人工生态修复方式，对土壤的机械组成、养分含量等理化性质，土壤微生物生物量及植物地上部群落的多样性等19 个指标进行了主成分分析，筛选了特征值大于1 的5 个主成分，以每个主成分所对应的特征值的权重计算综合主成分值，并对综合主成分值进行排序。由综合得分排名可知（表4），接菌区中等密度＞对照区中等密度＞接菌区高密度＞对照区高密度＞接菌区低密度＞对照区低密度。

表4 不同处理植被与土壤改良效应综合得分及排名Tab. 4 Comprehensive score and ranking of vegetation diversity and soil improvement with different mycorrhizal and planting diversity treatments

3 讨论

林下植物生物量和多样性是衡量生态修复功能的重要指标，反映了林下植物对资源的获取能力以及林下植物的丰富度，在维持生态系统的稳定性过程中发挥着重要的作用（金锁等, 2020; Areset al., 2010）。研究表明，乔木层不同郁闭度可以影响乔木层截留的光照和水分等资源，影响林下灌木层和草本层植被生长和分布（张筱等, 2021）。本研究中，研究区域位于西部采煤沉陷区，原有植被群落结构简单，土壤贫瘠，种植乔木等植被存在一定难度。沙棘是西部采煤沉陷区植被恢复的重要灌木，为胡颓子科，根系发达，能与弗兰克氏菌发生共生固氮作用，改善土壤状况，为其他植物提供良好的环境，常被作为是改善损伤生态系统的“先锋植物”（张爱梅等, 2020）。沙棘种植多年后，不同沙棘人工林的种植密度下形成了不同的现有密度和沙棘灌木林的盖度，造成了不同的沙棘优势度。沙棘的林下植物的优势物种以芹叶铁线莲和糙隐子草等多年生植物，属于灌草复合的生态系统，生态系统具有稳定性强的特点。而自然恢复区的植被优势物种以毛乌素沙地先锋物种油蒿和一年生草本植物刺穗藜、狗尾草（孙迎涛等, 2022），结构简单（图4）。在低种植密度和中等种植密度下，林下植物的生物量显著高于高种植密度，林下植物盖度也高于高种植密度（图2）。因此，合理的种植密度能够促进林下植物生长和正向演替，高种植密度限制林下植物生物量和盖度，延缓了植物群落的演替和生态回复的速度。以往的研究表明，林下植物的多样性指数在灌木层和草本层呈现出不同的响应机制（舒维韦等, 2021）。林下植物的Pielou 均匀度指数与Simpson 优势度指数在不同沙棘林密度下，具有显著性差异（图3）。随着种植密度的增加，林下植物的Pielou 均匀度显著增加，而Simpson 优势度显著降低。Pielou 均匀度不受物种丰富度的影响，仅仅表示物种的数目在群落中分布的均匀程度（马克平等, 1995）。在杉木林研究中，随林分密度降低，灌木获得了更大的生存空间和养分资源，草本植物的生长受到限制，使其林下草本层植物的多样性和均匀度降低（谷振军等, 2021; 张柳桦等, 2019）。本研究中随着种植密度的增加，沙棘人工林的优势度增加，占据更多的空间和资源，灌木以及多年生的草本植物的资源获取受到限制，林下植物群落趋向于简单的一年生草本（图4），降低了灌木对资源的竞争优势，从而提高了林下植物群落的整体均匀度。因此，中等种植密度更有利于林下植物的多样性和稳定性。

林分密度改变了林下植物的群落结构，影响林下生境，导致林下土壤的理化性质和微生物性状产生差异（张勇强等, 2020; 丁凯等, 2021）。随着沙棘人工林种植密度的增加，沙棘根系分泌有机酸等化学物质促进土壤养分循环，改善养分状况。同时，沙棘具有较强的根蘖能力，合理的种植密度可快速形成灌丛，增强了根系的固土，抗侵蚀能力，有利于改善土壤结构（董哲等, 2012）。土壤含水量和机械组成是土壤重要的物理性质。本研究中，不同的沙棘林种植密度对土壤含水量无显著性影响，显著影响了其机械组成（表2）。中等和高种植密度的土壤黏粒含量和粉粒含量显著高于低种植密度。土壤的黏粒含量和粉粒含量与人工林盖度、土壤有机质、全氮以及微生物性状具有显著的正相关关系（图6）。Ec 值是反映土壤中无机盐离子的重要指标，与土壤中碱解氮、有效钾、有效锌等含量具有显著的正相关性（田祥珅等, 2021）。本研究中，土壤电导率较低，随着沙棘林种植密度增加，Ec 呈现先增加后降低的“单峰”型变化，在中等种植密度下土壤Ec 值最高（表2）。随着种植密度增加，AMF 生物量与菌根侵染率均呈现逐渐增加的趋势，说明随着种植密度增加，AMF 能够从植物获取更多资源，植物对AMF 的依赖性增加。

当前关于人工林种植密度与接种AMF 对生态修复的交互作用的研究较少。AMF 与植物形成共生关系后，可以提供给植物N、P 等养分和水分，作为“回报”，植物为AMF 提供其生长所需的碳源（Kierset al., 2011）。本研究发现，虽然人工林密度和接种AMF 均显著影响了林下植物的Pielou 均匀度指数和Simpson 优势度，但是在接菌区，种植密度对林下植物的Simpson 优势度指数的影响并不显著（图3）。通过对林下植物进行主成分分析和聚类分析发现，接菌区林下植物群落的优势物种均为多年生灌木与草本植物；而对照区高种植密度下的林下植物群落的优势物种仅为多年生草本植物与一年生草本植物，群落结构与自然恢复区更加相似（图4）。因此，合理的种植密度和接种AMF 林下植物群落结构更加复杂，有利于提高生态系统的抗干扰能力，进而提高生态系统的稳定性。在对照区，AMF 的菌丝密度、孢子密度、菌根侵染率在不同种植密度下具有显著差异，而接菌区无显著差异，均高于对照区。接种AMF 后，土壤的养分得到了改善，土壤的全磷含量和有效磷含量显著高于对照区（表2）。以上的结果表明，接种AMF 后，AMF与沙棘的共生关系更加紧密，促进了土壤中养分的活化，减少种植密度对林下植物生长的抑制作用（悦飞雪等, 2019）。土壤中的AMF 生物量显著增加，AMF的生物量与土壤有效磷具有显著的负相关关系（图5）。一方面，巨大的菌丝网络可以突破根系的养分耗竭区，扩大根系的吸收范围。另一方面，AMF 可以与解磷细菌互作，活化土壤中难利用态的磷（Zhanget al., 2016），缓解了高林分密度对土壤养分和林下植物的抑制作用。接种AMF 后，AMF 与沙棘形成了良好共生关系，改善了林下植物的生长环境，为林下植物的生长提供了更多的生态位，打破了沙棘优势度过高所带来的养分限制，促进了林下植物正向演替。在植被恢复的过程中，随着植被生长和更新，植被群落的物种组成和多样性会发生变化，动态监测不同密度及接种AMF人工林的生态效应具有重要意义。

4 结论

中等种植密度沙棘人工林林下植被生物量、AM真菌生物量、微生物生物量及土壤理化性质均处于较高水平，生态修复效果最佳；接种AMF 促进了土壤养分的活化，为沙棘人工林提供了更多的生态位，打破了种植密度过高对林下植被生长和正向演替的限制。