吴茱萸次碱调控TGF-β1/Smad3信号通路改善小鼠溃疡性结肠炎的作用机制研究

水寅萍,濮之晨

(1. 皖南医学院研究生学院,安徽 芜湖 241002;2. 皖南医学院弋矶山医院,安徽 芜湖 241001)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是炎症性肠病的主要形式,患者的肠黏膜出现慢性炎症和溃疡[1-2]。持续反复腹泻、血便、脓便、腹痛及全身症状是UC的主要临床表现[3]。国外其发病率为十万分之八,在中国则为每十万分之二,且呈逐年上升。并且,由于UC的难以根治,患者面临较高的癌变风险。有9%～10%的UC患者因结直肠癌而死亡[4-5],目前UC的发病机制尚未完全阐明,多数学者认为免疫系统障碍和肠道微生物失衡、环境变化、基因变异等因素与UC的发生密切相关[6-7]。现临床治疗UC常用药主要包括氨基水杨酸类、免疫抑制剂、类固醇和一些生物制剂等[8]。但是这些药物会引起诸多不良反应如恶心、呕吐;库欣综合征;骨髓抑制和感染等问题[9]。

TGF-β1是一种调节细胞生长及分化的抗炎细胞因子,具有多种生物学活性,对淋巴细胞增殖和功能有抑制作用,并且抑制巨噬细胞的激活[10-11]。Smads家族成员是TGF-β下游的信号分子,而Smad3是这一信号通路重要的启动者[12],帮助TGF-β从细胞外转导到细胞核内[13]。TGF-β1/Smad3可通过诱导细胞外基质成分胶原蛋白和黏蛋白的合成,减少细胞外胶原蛋白分解酶的释放,促进纤维化形成,有益于损伤组织的纤维化修复信号通路调控免疫反应[14-17],但同时TGF-β为化学趋化因子,对单核细胞具有促炎作用,可能会加重肠道炎症[18],有研究表明TGF-β1/Smad3在UC模型的大鼠中明显升高,提示该通路可能在UC的发生中发挥重要的作用[17-19]。

Rut是从吴茱萸中分离出来的具有生物活性的生物碱,吴茱萸是一种在临床上用于治疗头痛、腹痛、产后出血、痢疾和闭经的多功能中药,Rut作为其中最具代表性的吲哚吡啶喹唑啉类生物碱对治疗各种心脑血管和代谢疾病具有显著的药理作用。之前的研究发现了Rut对UC模型小鼠具有一定的治疗作用,但其中潜在的分子机制仍未阐明,本次实验研究的主要目的是研究Rut治疗UC模型小鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 本研究选用SPF级雄性昆明小鼠50只,8周龄,体重19～23 g,小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司[动物使用许可证号：SYXK(Wan)2022-4534],小鼠均饲养在安徽医科大学动物中心,每周检查食物摄入量和体重。所有实验程序均经安徽医科大学动物实验伦理委员会批准(LISC20180460)。

1.1.2 试验试剂 Rut购自德斯特生物,IL-6、TNF-α 、IL-1β ELISA试剂盒、HE染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,BCA蛋白浓度测定试剂盒、WB检测试剂盒、DAB化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司,GAPDH抗体、TGF-β1、Smad3/p-Smad3一抗抗体和山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG购自Affinity、葡聚糖硫酸钠(DDS)购自陶素生物。

1.1.3 实验仪器 多功能酶标仪(德国徕卡公司);凝胶成像系统(美国伯乐公司);电泳设备(美国伯乐公司);电子分析天平(深圳市奥斯微光学仪器有限公司);麻醉机(上海勤翔科学仪器有限公司);SC-2546 低温高速离心机(美国 Thermo Fisher 公司);倒置荧光显微镜(德国徕卡公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 UC模型小鼠的构建和吴茱萸碱的治疗 在适应性喂养1周之后,将小鼠分为5组(n=10)：对照组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。对照组小鼠给予无菌水,模型组和治疗组小鼠给予含有3%DSS水,小鼠均可自由获得水源。在造模1周后,低剂量组、中剂量组、高剂量组分别按照10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kg来灌胃Rut,对照组和模型组小鼠每天灌胃等量的生理盐水,持续1周后解剖取材。

1.2.2 小鼠体重的测量 从试验造模到结束,每天都测量小鼠的体重,通过小鼠体重的变化来判断小鼠的的疾病状态。

1.2.3 ELISA检测小鼠的肠组织中的IL-6、TNF-α、IL-1β的含量 将各组小鼠的肠组织加入生理盐水后研磨,离心10 min(4 ℃,3000 r/min)后取上清,按照试剂盒说明书配制试剂、标准品、样品。接着加样、加酶、温育、配液、洗涤,最后显色,用酶标仪测定各孔的吸光度值。

1.2.4 HE检测各组小鼠肠组织的病理变化 组织切片置于二甲苯Ⅰ中12～15 min,再置于二甲苯Ⅱ中12～15 min,分别置于无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中各5～10 min,依次置于90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5 min,最后浸没于蒸馏水5 min,使其彻底水化,置于苏木素染液5 min后用流水冲洗10 min,过蒸馏水后浸没于伊红染液15 s,随后继续流水冲洗10 min,洗去未结合的染液,烘干切片后中性树脂封片,显微镜下拍片观察。

1.2.5 Western Blot检测各组小鼠中TGF-β1/Smad3蛋白表达 将蛋白定量后,样品加入到胶孔中,倒入充足电泳液且加样后开始电泳,初始电压为75 V,大约30 min,待marker分离后调至120 V直到条带跑到玻璃板最底部为止(大约60 min),将提前于甲醇中活化的PVDF 膜根据“黑胶白膜”模式覆盖于胶上(膜和凝胶之间防止出现气泡),在恒定电流为200 mA条件下开始转膜;将转膜结束的PVDF膜浸泡于5%的脱脂牛奶中,摇床上孵育1～2 h,TBST洗5 min,重复4次,根据抗体说明书提前配置一抗,将PVDF膜浸泡于对应的抗体稀释液中,4 ℃轻摇孵育过夜,室温下复温30 min 后 TBST 洗5 min,重复4次,根据抗体说明书提前配置二抗,摇床上孵育1～2 h,TBST洗5 min,重复4次,避光配制显色液,涡旋混匀后用伯乐显影仪曝光。

2 实验结果

2.1 小鼠的体重变化 与对照组相比,第7天到第14天模型组小鼠的体重降低(P<0.05),在给予Rut治疗后,小鼠的体重有了一定程度的恢复,见表1。

表1 各组小鼠体重列表 单位：g

2.2 各组小鼠肠组织HE染色结果 由图1 HE染色结果可以看出,对照组各层结构清晰无缺损,分层明显,未见炎症细胞浸润。模型组黏膜层缺损不完整,黏膜层及黏膜下层结构模糊不清晰,可见大量炎症细胞浸润。低剂量组部分黏膜层缺失,黏膜层结构模糊,较多炎症细胞浸润。中剂量组和高剂量组各层结构较清晰,小部分黏膜层缺损、稍模糊,较少炎症细胞浸润。

图1 小鼠肠组织HE染色(×200)

2.3 小鼠肠组织中相关炎症因子的表达 与对照组相比,模型组小鼠肠组织中的炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β 水平升高(P<0.05);在给予Rut治疗后,小鼠肠组织中的IL-6、TNF-α、IL-1β下降,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组小鼠肠组织中的IL-6、TNF-α、IL-1β对比结果 单位：mmol/L

2.4 TGF-β1/Smad3在小鼠肠组织中的表达 与对照组相比,模型组小鼠的肠组织中TGF-β1的表达升高(P<0.05),总Smad3的表达未出现显著变化,但是p-Smad3的表达升高(P<0.05);与模型组相比,Rut治疗组的TGF-β1表达减少(P<0.05),并且在总Smad3不变的情况下,p-Smad3的表达降低(P<0.05)。 见图2。

注：与对照组比较,**P<0.01;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01。

3 讨论

UC是一种慢性炎症性疾病,[20]由免疫反应失调、肠道菌群失调和遗传易感性共同引起。肠道菌群和肠道免疫系统可能在这种疾病中起着至关重要的作用[21]。临床特征主要包括如腹泻、痰、脓、血便、腹部疼痛等,UC是反复发作的慢性疾病而且可以发生在任何年龄,对男性和女性都是如此,常见于中青年,虽然治疗UC的主要药物有显著的治疗效果,但长期使用已出现不良反应,长期以来在中国和许多其他亚洲国家广泛使用的中药,可能为UC患者提供另一种选择[22]。Rut是中国传统的中药之一,具有多种药理活性,在多种疾病中都显示出其功效,有研究表明[23],Rut可以通过抑制NF-κB信号通路从而抑制炎症发挥对糖尿病小鼠系膜细胞的保护作用。对于特应性皮炎,Rut可以通过抑制多种炎症因子如IL-4、IL-5、IL-13来发挥治疗作用[24]。并且Rut对于小鼠肝脏缺血再灌注损伤也有一定的保护作用[25]。一项较早的研究也表明Rut可以抑制炎性浸润、渗出和组织增生,减轻结肠黏膜的病理损害和抑制肠道平滑肌运动,对实验性动物急性结肠炎有较好的治疗作用[26],但其并未对药理机制进行进一步的探索。

本研究表明Rut对于小鼠的UC有缓解作用,其原因可能与其抗炎的作用有关。本次实验研究结果表明,炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β在UC小鼠的肠组织中出现了显著升高,过高的炎症水平可能破坏肠组织细胞中的平衡从而引起肠损伤,HE的结果也印证了这一点。在给予Rut之后,小鼠肠组织中的IL-6、TNF-α、IL-1β都出现了较为明显的下调,同样HE结果也显示了Rut治疗可以有效缓解UC引起的肠损伤,这种药理作用具有一定的浓度依赖性,这一作用可能是通过TGF-β1/Smad信号通路实现的。

TGF-β1是参与到机体炎症免疫的重要细胞因子,它可以激活下游的Smad3,这一信号传导可能会导致炎症在细胞内的积累[27-28],炎症的发生发展是UC造成机体损伤的重要原因。研究发现在UC小鼠中,TGF-β1被大量激活,从而进一步激活了下游的Smad3,使其大量磷酸化从而促进了炎症的发生发展,而在Rut治疗后,TGF-β1和p-Smad3/Smad3的表达量均有显著的下调,从而表明了在小鼠中Rut是通过调控TGF-β1/Smad信号通路来改善UC的。本研究为今后临床上治疗UC提供了相应的理论基础。