加减地黄饮子对衰老小鼠睾丸组织SIRT3基因表达的影响*

黑龙江省中医药科学院

高 山 张佩青 杨 光△ 李长见△(哈尔滨 150036)

提要 目的：观察加减地黄饮子对衰老小鼠睾丸组织沉默信息转录调节基因3(SIRT3)表达的影响。方法：选取2月龄雄性ICR小鼠作为青年组，20月龄小鼠作为老年组、维生素E组和加减地黄饮子组。青年组、老年组以生理盐水灌胃，维生素E组、加减地黄饮子组以对应药物灌胃。干预60 d后计算睾丸器官指数，观测睾丸组织病理学变化，检测各组小鼠血清睾酮和肝肾功能，检测睾丸组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平，以RT-PCR和Western-blot法检测SIRT3基因的mRNA和蛋白表达。结果：与老年组比较，加减地黄饮子组小鼠睾丸器官指数无差异(P>0.05)；睾丸组织结构清晰稳定，精原细胞、精母细胞、支持细胞增多；血清睾酮水平升高，肝肾功指标正常，SOD、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，SIRT3基因mRNA及其蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：加减地黄饮子可能影响SIRT3基因表达，减少小鼠睾丸氧化应激损伤而延缓睾丸衰老。

衰老是所有生物都会出现的自然现象，从细胞到组织，从器官到系统，随时间出现结构和功能衰退[1]。在各个系统衰老中，生殖系统的变化对人体影响较大。老年男性性腺睾丸的功能不断下降，引起肌肉、骨骼、精神、心理、性功能等一系列变化[2]。延缓睾丸衰老可以提高男性肌体状态，改善生理功能，意义深远。

中医中药在补肾抗衰老方面优势独到，加减地黄饮子源于金代名方地黄饮子。地黄饮子是补肾的经典方，在前期研究中发现此方具有良好的延缓衰老作用[3]。课题组根据当代人体质和发病谱的变化，依据临床反馈，进行了配方的加减[4]。临床应用中去掉附子、肉桂等过热药物，强化抗衰老作用，加入薄荷、桂枝、酸枣仁等，化裁形成加减地黄饮子。在男性早衰、男性功能下降等疾病治疗中体现出良好疗效。沉默信息转录调节基因3(SIRT3)基因发现与人类长寿关系密切[5]，对肌体内环境氧化、自噬、凋亡和能量代谢起重要调节作用[6-9]，具有减少氧化应激诱发的功能性和器质性损伤的作用。前期研究发现调控SIRT家族可以干预泌尿系统衰老。在此基础上本实验观察加减地黄饮子对小鼠睾丸的抗衰老作用，试图从抗衰老基因SIRT3分析内在作用机理。

1 材料

1.1 动物 雄性ICR小鼠60只，订购于哈尔滨医科大学动物实验中心，生产许可证号为scxk黑2012-001。2月龄15只，体质量25～30 g；20月龄45只，体质量40～45 g。在20℃～25℃、自然照明、自由饮水进食条件下饲养[4]。此次实验经黑龙江中医药大学科研伦理委员会批准开展，动物实验编号DW20221005。

1.2 药物与试剂 血清睾酮试剂盒：武汉华美公司；逆转录试剂盒(批号2001360)：上海秋博公司；β-action鼠单克隆抗体(批号063257)：广州博欧特公司；SIRT3单克隆抗体(批号080731)：日本Anathia公司。维生素E(批号53188 0701)：西安海斯夫公司；加减地黄饮子水煎液：黑龙江省中医药科学院制备，药剂浓度260 mg/mL[4]。

1.3 仪器 BK-280全自动生化分析仪：山东博科公司；超声碎裂仪：上海静信公司；多功能酶标仪：山东恒美公司；DNA电泳仪：Bj Liuyi Biotechnology。

2 方法

2.1 分组及干预 按月龄划分小鼠年龄组，2月龄为青年期，20月龄为老年期。设定2月龄小鼠为青年组，20月龄小鼠随机分为老年组、维生素E组、加减地黄饮子组。每组动物均为15只，以灌胃形式给药。青年组、老年组灌注生理盐水，每日10 mL/kg。维生素E组和加减地黄饮子组分别按0.25 g/kg、2.6 g/kg灌注对应药物[4]。各组均给药60 d。

2.2 标本采集与处理 标本采集前以乙醚吸入方式麻醉小鼠，起效后称重。先用眼球取血法收集血液标本，离心后取上清液备用。取小鼠腹部手术切口，进入腹腔后充分显露两侧睾丸并取出，生理盐水冲洗后称重备用。

2.3 睾丸器官指数测算 称量睾丸重量和小鼠体质量。睾丸指数计算公式为睾丸重量(g)/体质量(mg)×100%。

2.4 睾丸组织病理学观测 石蜡包埋小鼠睾丸标本，制作病理切片。以HE染色法观察睾丸结构及精原细胞、精母细胞、支持细胞的数量形态。

2.5 睾酮、肝功能、肾功能检测 ELISA法检测血清睾酮水平。全自动生化分析仪检测血清尿素氮、肌酐、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平。

2.6 睾丸组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性检测 睾丸标本经过充分裂解，离心得到上层清液。以硫代巴比妥酸法检测MDA活性，以酶学方法检测SOD、GSH-Px活性[4]。

2.7 测定SIRT3基因mRNA表达 分离纯化提取总RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR法检测。反应条件：90℃下预变性1 min，90℃下变性15 min，60℃下退火1 min，70℃下延伸20 s，30个循环[4]。反应体系：总反应容积25 μL，cDNA2 μL，上下游引物均为2.5 μL。PCR引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.8 测定SIRT3基因蛋白表达 Western blot法定量测定睾丸组织蛋白表达。配制工作液，提取标本蛋白。电泳，转膜，封闭，先后经过一抗、二抗，曝光[4]。图像以Med8.0数码系统分析。

3 结果

3.1 各组睾丸器官指数比较 青年组睾丸器官指数最高，其余3组显著下降(P<0.05)。比较老年组，维生素E组和加减地黄饮子组器官指数差异无统计学意义(P>0.05)。比较维生素E组，加减地黄饮子组器官指数差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组睾丸器官指数比较

3.2 各组睾丸病理学比较 HE染色后，在10×20倍光镜下阅片观察。青年组小鼠睾丸结构饱满，精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子数量丰富，排列整齐有序，组织间隙支持细胞含量较多。老年组睾丸结构变形，精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子数量减少，排列杂乱，组织间隙支持细胞含量减少。与老年组比较，维生素E组和加减地黄饮子组睾丸组织结构清晰稳定，精原细胞、精母细胞、支持细胞增多。与维生素E组比较，加减地黄饮子组精原细胞、精母细胞、支持细胞数量更为丰富。见图1。

注：A.青年组；B.老年组；C.维生素E组；D.加减地黄饮子组图1 各组睾丸组织病理学比较

3.3 各组睾酮、肝功能、肾功能水平比较 青年组睾酮水平最高，老年组下降(P<0.05)；比较老年组，维生素E组睾酮差异无统计学意义(P>0.05)，加减地黄饮子组升高(P<0.05)；比较维生素E组，加减地黄饮子组睾酮升高(P<0.05)。详见表3。青年组肝肾功能指标数值最低，其余3组指标升高(P<0.05)，但均在正常值范围内；3组间差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表3 各组睾酮水平比较

表4 各组BUN、Scr、ALT、AST水平比较

3.4 各组睾丸组织MDA、SOD、GSH-Px水平比较 青年组MDA水平最低，SOD、GSH-Px水平最高。老年组MDA上升，SOD、GSH-Px下降(P<0.05)。比较老年组，维生素E组SOD上升(P<0.05)，GSH-Px和MDA差异无统计学意义(P>0.05)；加减地黄饮子组MDA降低，SOD、GSH-Px上升(P<0.05)。比较维生素E组，加减地黄饮子组MDA下降，SOD、GSH-Px上升(P<0.05)。详见表5。

表5 各组SOD、GSH-Px、MDA水平比较

3.5 各组睾丸组织SIRT3基因mRNA及蛋白表达水平比较 青年组SIRT3基因mRNA及蛋白表达水平最高。老年组小鼠睾丸组织SIRT3基因mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。比较老年组，维生素E组SIRT3基因mRNA及蛋白表达，差异无统计学意义(P>0.05)；加减地黄饮子组mRNA及蛋白表达升高(P<0.05)。比较维生素E组，加减地黄饮子组SIRT3基因表达升高，mRNA及蛋白表达一致(P<0.05)。详见表6、图2。

注：A.青年组；B.老年组；C.维生素E组；D.加减地黄饮子组图2 各组睾丸组织SIRT3基因蛋白表达水平比较

表6 各组SIRT3基因mRNA表达水平比较

4 讨论

睾丸是男性生殖系统的重要器官，既是生殖功能的核心，也是雄性内分泌功能的关键。男性从出生到成熟，从强壮到衰老，从生精到雄激素分泌，睾丸的生理作用伴随终生。人体进入老龄后，所有系统都在衰老，生殖系统也不例外。但生殖系统衰老对男性具有特殊意义。一方面人体失去繁衍生殖的能力，另一方面睾酮缺乏出现疲倦、乏力、焦虑、抑郁和性功能下降一系列身心紊乱的表现。而后者给生活带来的影响更大，对衰老的恐惧，对性功能和强壮肌体的丧失，让男性产生巨大心理压力。因此如何干预睾丸衰老，什么时间、什么方式干预衰老，及时有效的干预睾丸衰老具有现实研究意义[10]。

目前研究表明中药具有延缓衰老的确切作用，尤其是补肾的方剂千百年来层出不穷，通过补肾填精来延年益寿已成为历代医家的共识。肾藏精，主生殖。《黄帝内经》记载肾精贯穿男性生殖始终。男子“二八，肾气盛，天癸至，精气溢泻”，肾精充盈出现遗精射精，为生殖初始。“五八，肾气衰，发堕齿槁”，肾精不足而开始肌体衰老。“七八，天癸竭，精少……形体皆极”，肾精虚损而生殖枯竭。如何补肾精？不同医家认识不一、方药各异，常见汤方以温补肾阳治则居多。对于生殖衰老的男性，需认识到滋补肾阴和肾阳同样重要，不宜厚此薄彼。肾阴是生殖的物质基础，肾阴虚损发生于内，缓慢而隐匿。肾阳是生殖的功能体现，肾阳虚形之于外，明显易于识别。肾阴与肾阳两者互根互用，相互交感，水火既济。两者的虚损多同时发生，若只温补肾阳，则孤阴不生、独阳不长，导致太过温燥而肾精不充。所以填精宜肾阴肾阳双补，兼顾阴阳平衡的补肾方剂，以达“阴平阳秘、精神乃至”。

地黄饮子首载于《宣明论方》，选取滋肾阴、补肾阳的药物，如熟地黄、山茱萸、巴戟天、肉苁蓉、石斛、远志等。可以补益下元虚衰，是治疗肾虚喑痱的主方。熟地黄是方中君药，具有延缓人体衰老的作用。其特有的活性成分熟地黄多糖具有体外抗氧化性[11]。巴戟天补肾强筋骨，可以提高皮质醇水平，从而保护生殖系统、促进生精和改善肾虚证等作用[12-14]，用于治疗肾虚阳痿不育、宫寒不孕、遗精滑精等证[12-15]。肉苁蓉补五劳七伤，肉苁蓉多糖可以提高细胞核内P-CREB水平，增加环腺苷酸及cAMP依赖蛋白激酶活性[16-18]。地黄饮子具有提高大鼠SOD、CAT、GSH，降低MDA的作用，清除自由基而对抗氧化损伤[19]。

维生素E具有公认的抗氧化应激作用，因此是抗衰老实验最常选择的对照药物。维生素E作为抗氧化剂，长久以来应用于男科生殖疾病。对于精子活力不足的弱精子症，维生素E一直是专家共识的推荐药物。本实验中维生素E组睾丸的病理结构明显改善，SOD活性升高表明维生素E作为对照药物的正确性和有效性。但在睾酮改善方面未看到显著作用。

病理学显示老年组睾丸组织整体出现萎缩、结构杂乱，精原细胞和精母细胞排列松散、数量减少，精子细胞、精子较青年组明显减少。表明老年组小鼠生精功能进入衰退期。加减地黄饮子组睾丸组织结构相对清晰稳定，精原细胞、精母细胞和支持细胞数量远多于老年组。表明睾丸结构的衰老得到了延缓，生精功能的细胞基础得到了保护。

睾酮是雄激素最主要的成分，在男性血液中按昼夜节律不停地分泌。对维持性欲、性征、性功能，促进精子成熟，对中枢系统、骨骼系统和免疫功能都有着重要的作用。某种程度上男人是雄激素的“作品”。本研究中与青年组比较，老年组睾酮明显降低，这与睾丸病理学改变相一致。而加减地黄饮子组无明显降低，表明本方对小鼠雄激素分泌产生了干预作用。对于延缓睾丸衰老，睾酮是干预的靶点，也是疗效评定的指标。由于衰老因素，用药干预60 d后老年鼠肝肾功指标高于青年鼠，但老年组、维生素E组、加减地黄饮子组间无差异；且均在正常值范围内，证明药物及疗程的动物安全性。

关于解释生物衰老原因，以及如何干预衰老，氧化应激理论是经典的衰老研究路径。课题组前期实验发现加减地黄饮子对海马组织、肾脏组织都有对抗氧化应激损伤，提高SOD等生物酶活性而延缓衰老的作用[4，20-21]。SOD等酶是抗衰老研究常用的指标，具有代表意义。因此本实验试图探索加减地黄饮子对睾丸组织是否具有同样的抗衰老作用。实验结果显示实验组睾丸组织SOD、GSH高于对照组，MDA低于对照组，表明氧化应激损伤减少。SOD、GSH活性升高增加了对氧自由基的清除，MDA活性降低可以减少细胞的结构和功能破坏而引发的老化。在对活性酶的双重调节下，加减地黄引子起到了减少氧化应激损伤的作用，保留了睾丸性激素分泌功能，延缓了小鼠睾酮下降。

SIRT是Sirtuin基因家族成员，从T1到T7分布在不同的细胞器上。课题组前期研究发现与加减地黄饮子药效成分相关的梓醇通过调控SIRT1基因的表达，干预大鼠肾脏衰老[21]。SIRT3与人类长寿有一定相关性[22]，增强氧自由基清除酶的活性，减少氧自由基的蓄积，可以调节氧化应激诱发的功能性损伤和器质性损伤。因此SIRT3与抗衰老关系密切，在动物模型中敲除该基因的小鼠迅速衰老[23]。能否影响该基因的表达来延缓睾丸衰老，这是我们重点关注的，因此选择SIRT3作为重要的观测指标。结果显示与睾酮、抗氧化酶升高相一致，实验组小鼠SIRT3基因mRNA和蛋白表达升高。根据结果分析，可能在加减地黄饮子影响下，SIRT3基因表达升高，睾丸组织SOD、GSH活性上升，减少了局部氧化应激损伤，改善了睾丸组织结构和功能，从而影响了小鼠雄激素分泌，延缓睾丸衰老。综上分析加减地黄饮子具有一定的延缓小鼠睾丸衰老作用，对SIRT3基因的影响可能是其内在机制。