酸枣仁中黄酮类成分的研究进展

李宝剑，杨远贵*，宋忠兴，唐志书，2*（.陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心/秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西 咸阳 72083；2.中国中医科学院，北京 00700）

酸枣仁为鼠李科枣属植物酸枣的干燥成熟种子，有生、炒两种用法，主要分布在我国陕西、山西、河北等地[1]。《本草纲目》记载：“枣仁，味酸性收，故主肝病，寒热结气，酸痹久泄，脐下满痛之症。”研究发现，酸枣仁成分多达130余种，包括黄酮类、皂苷类、生物碱类、脂肪酸类等，具有镇静安眠、抗抑郁、抗氧化、抗炎、改善学习记忆等药理作用[2]。临床广泛应用于酸枣仁汤、归脾汤、天王补心汤、枣仁安神颗粒、天王补心丸、柏子养心丸等中成药。

酸枣仁总黄酮质量分数为3.94%，是酸枣仁的主要活性成分之一，其结构主要有黄酮、二氢黄酮、黄酮醇和异黄酮等。黄酮是广泛存在于自然界、种类繁多且具有广泛生物活性的成分，是中药中一类重要的有效成分[3]。研究表明，酸枣仁中黄酮类成分具有镇静安眠、抗焦虑、抗氧化、改善记忆障碍、保护心脏等生物活性[4]。近年来，已有酸枣仁化学成分的化学结构、分析方法和生物活性的相关报道，本文通过对酸枣仁中黄酮类成分化学结构、提取方法、分析方法和生物活性进行归纳，以期为其开发利用提供参考。

1 酸枣仁中的黄酮类成分

黄酮类化合物是一种多酚类化合物，其化学结构多样，但总体骨架由15个碳原子（C6-C3-C6）组成A、B环，通过杂环吡喃环连接[5]。截至目前，共从酸枣仁中发现报道了44个黄酮类成分（见表1和图1），其中黄酮31个（化合物1～31），黄酮醇8个（化合物32～39），二氢黄酮2个（化合物40～41），异黄酮3个（化合物42～44）[6-26]。这些黄酮类成分大多以黄酮苷的形式存在，主要为碳苷和氧苷，此外，还有少量氮苷。葡萄糖主要与黄酮类成分中3位和7位羟基脱水缩合成氧苷，与3位、6位和8位碳脱水缩合成碳苷。研究发现，B环中的羟基结构可以促进活性氧（ROS）和活性氮（RNS）清除，发挥抗氧化作用[27]。此外，黄酮的特殊结构还可以减少高度氧化的自由基，从而减少ROS形成，减少氧化应激反应。这一特性使其成为有效的过氧自由基、超氧化物和过氧亚硝酸根自由基清除剂，并进一步发挥多方面疾病的药理活性[5]。

表1 酸枣仁中黄酮类成分Tab 1 Composition of flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen

图1 酸枣仁中黄酮类成分化学结构Fig 1 Chemical structures of the flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen

2 酸枣仁中黄酮类成分的提取方法

高效的提取方式，对酸枣仁化学成分及其药理作用的研究具有重要意义。目前酸枣仁中黄酮类成分的提取方法主要有浸提法、加热回流法、超声波辅助提取法、酶提法和其他提取方法（见表2）[28-46]。

表2 不同方法提取酸枣仁中黄酮类成分的工艺参数Tab 2 Process parameters for extracting flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen using different methods

浸提法和加热回流法作为酸枣仁中黄酮类成分传统提取方法，研究多采用单因素法与正交试验或与响应面法相结合，以酸枣仁中总黄酮提取率为指标，对其提取工艺进行优化。研究发现，影响加热回流提取工艺时的因素作用大小的顺序为：醇浓度＞提取时间＞回流次数＞加醇量[33]。

超声波辅助提取法是指中药材被提取溶剂浸润和渗透，使有效成分析出并溶解于提取溶剂，通过组织细胞内外的浓度差和渗透压差进行扩散，进一步得到浸提液的一种提取方法，具有节能、高效等优点[47]。近年来有学者采用响应面法对提取酸枣仁中黄酮类物质的方法进行了优化，进一步提高了提取效率[36-37，39-42]。采用正交试验优化超声辅助提取时，发现各因素作用大小的顺序为：液固比＞乙醇浓度＞提取时间＞提取温度＞功率[38]。

酶提取法是指通过酶类物质破坏植物细胞壁结构使其有效成分从细胞质中溶解分离出来的一种提取方法，常用的酶主要有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等。近些年关于酸枣仁中黄酮类成分提取工艺研究发现，采用纤维素酶和复合酶作为提取用酶，在复合酶的工艺改进研究中，其提取率相比于水提法效率提高了54.67%[46]。酶提法具有高效、环保、便利等优点，具有较大的开发潜力。

酸枣仁中黄酮类成分提取方法研究较多，其中浸提法和加热回流法中影响提取率的因素主要是溶剂的浓度、料液比、提取时间、提取次数等；超声波辅助提取法缩短了提取时间，相比于加热回流更节能环保，其提取率主要受超声功率、溶剂浓度、提取时间、料液比影响；酶提法提取率主要受酶的种类、pH值、提取时间等影响。在酸枣仁中黄酮类成分提取工艺改进中，超声波辅助提取法应用最为广泛，提取率高且适合进一步大规模应用于工业化提取，可进一步对其在酸枣仁中黄酮类成分的提取工艺优化进行深入研究，为工业化提取和产业化应用提供便利。

3 酸枣仁中黄酮类成分的分析方法

酸枣仁中黄酮类成分的分析测定已有较多相关研究，主要方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法和色谱-质谱联用技术等。本文对几种方法进行总结归纳（见表3）[29，48-64]。

表3 酸枣仁中黄酮类成分的不同分析方法Tab 3 Different methods for the analysis of flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法是常用的一种分析方法，具有应用广泛、灵敏度高、选择性好、准确度高、适用浓度范围广、分析成本低、操作简便且快速等优点[65]。此方法已广泛应用于酸枣仁中总黄酮的分析定量，为提取工艺改进提供了依据[29，48-50]。由于紫外分光光度法无法对单一的黄酮类化合物含量进行检测，因此限制了其进一步应用。

3.2 HPLC法

HPLC法是一种重要的定性定量分析方法，具有高速、高效、高灵敏度、应用范围广、样品量少等优点[66]。杨旭等[67]建立了酸枣仁黄酮的HPLC指纹图谱，并鉴定出其中的8个特征峰成分为维采宁-Ⅱ、牡荆素葡萄糖苷、异斯皮诺素、斯皮诺素、6'''-pyridyloylspinosin、6'''-对羟基苯甲酰斯皮诺素、6'''-阿魏酰斯皮诺素、6'''-对香豆酰斯皮诺素。此外，HPLC也应用于酸枣仁中药复方的含量测定，其中以斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素含量为代表，HPLC在相关成分的体内代谢分布研究方面也取得了很大进展，为临床用药提供了理论支持[51-53]。HPLC在酸枣仁中黄酮类成分分析中发挥着重要作用，并在药动学研究中可高效快速地对目标成分进行定性定量分析。

3.3 SFC法

SFC法是以超临界流体作为流动相的一种色谱方法，具有高效、经济环保、黏度低、流动速度快等优点，相比于HPLC、SFC柱效更高，分离时间更短，效率更高[68]。酸枣仁中黄酮类成分槲皮素、异槲皮苷等也有一些采用SFC分析的少量报道。作为一种新兴分析方法，在酸枣仁中黄酮类成分的分析中应用较少，但此方法因为其节能高效的优点，可作为酸枣仁黄酮类成分分离分析的重要工具。

3.4 LC-MS法

LC-MS具有进样量少、灵敏度高、分析速度快等优点，此外，该方法结合了色谱分离能力强和质谱定性能力强的优点，可准确测定分子量，确定分子式，对化合物的结构鉴定至关重要[69]。

酸枣仁中黄酮类成分多，单一成分含量较少。质谱具有高灵敏度，可以对酸枣仁中含量低的黄酮类成分进行准确定性定量分析，并分析出结构信息等，提高分析效率[70]。在液质联用法研究中，建立了UPLC/ESI-Q-Orbitrap、HPLC-MS、HPLC-ESI-MS/MS、HPLC-DAD等多种方法[61-68]。LC-MS法因高效、准确的优点，将逐渐成为酸枣仁中黄酮类成分分析的主要方法。

4 酸枣仁中黄酮类成分的生物活性

酸枣仁中黄酮类成分具有镇静安眠、抗焦虑、抗氧化、改善记忆、保护心脏、抗肿瘤等多种生物活性，相关作用机制方面研究也取得很大进展，对酸枣仁中黄酮类成分的药用价值提供了充分的理论支持。

4.1 镇静安眠、抗抑郁

镇静安眠、抗抑郁是酸枣仁在传统中医应用中最主要的功效。关于失眠和抑郁的发病机制目前主要有以下几种假说：单胺类及其受体假说、神经内分泌假说、神经元损伤假说和细胞分子机制假说等，其中“神经递质假说”得到研究者的普遍认可[71]。研究发现，酸枣仁中黄酮类成分主要通过调节5-羟色氨（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、γ-氨基丁酸（GABA）三种神经递质发挥镇静安眠、抗抑郁的药理作用[72]。Zhang等[73]研究发现，斯皮诺素可能通过下调C-Fos表达，从而降低神经元放电发挥镇静催眠的生物活性。研究发现，酸枣仁总黄酮可以下调谷氨酸（GLU）、上调脑源性神经营养因子（BDNF）发挥解郁安神的药理活性[55]。此外，Jiang等[74]研究发现，酸枣仁中黄酮的镇静安眠能力弱于酸枣仁皂苷，酸枣仁多糖无镇静安眠作用。

4.2 抗氧化

氧化应激是指在正常生理状态下，机体氧化与抗氧化系统失衡[75]。相关研究得出酸枣仁中黄酮类成分如斯皮诺素、当药黄素、异牡荆素、6'''-阿魏酰斯皮诺素等具有显著的抗氧化活性[5]，其主要是通过清除和减少自由基产生，可进一步应用于药品和护肤品中。薛晓芳等[76]对酸枣不同部位的抗氧化活性进行研究发现，酸枣仁中黄酮成分抗氧化能力最强，其他部位抗氧化能力依次是：叶片＞果皮＞花＞果实＞果肉。

4.3 改善记忆

记忆障碍是一种发生于中枢神经的退行性疾病，以阿尔茨海默病为代表。相关的发病机制主要有以下几种假说：细胞凋亡假说、神经突触假说、胆碱能神经递质假说、氧化应激损伤假说[77]。

研究发现，该类成分对由β-淀粉样蛋白（Aβ）诱导的记忆障碍具有明显改善作用，这可能是通过上调海马组织中磷酸化细胞外调节蛋白激酶（ERK）、细胞环磷酸腺苷应答元件结合蛋白（CREB）和BDNF水平发挥改善认知功能障碍的作用[78]。研究发现，斯皮诺素可能是通过激活核转录因子E2相关因子（Nrf2），上调血红素加氧酶1（HO-1）表达，抑制ROS产生，进而减少β-淀粉样蛋白-42（Aβ1-42）产生和聚集发挥改善记忆的药理作用[79]。总之，酸枣仁中黄酮类成分对认知障碍的改善功能显著，研究其作用机制，可为阿尔茨海默病等记忆疾病的药物开发奠定基础。

4.4 保护心脏

心脏疾病是导致人类死亡的主要原因之一，已经成为全球的主要公共卫生问题。研究显示，斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素可减少心肌酶释放和细胞凋亡，保护心肌细胞急性心脏缺血再灌注损伤[80]。任静娜等[81]研究发现，异牡荆素可以降低大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流，对急性心肌梗死、心律失常等疾病具有很好的心脏保护功能。研究发现，酸枣仁中的斯皮诺素和6'''-阿魏酰斯皮诺素对心脏保护的作用机制可能与其降低糖原合成酶激酶3β（GSK3β）在Tyr216处的磷酸化有关，从而发挥保护心肌细胞的活性[82]。

4.5 抗肿瘤

癌症已经成为威胁人类生命的头号杀手，在我国以肺癌、胃癌、肠癌等为主要代表的相关肿瘤发病率逐年升高。研究发现，异牡荆素具有抗非小细胞肺癌（NSCLC）的活性，其可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来抑制NSCLC细胞活性和自我更新，促进其凋亡[83]。异牡荆素还可以抑制癌症干细胞并诱导骨肉瘤细胞凋亡，可能是通过抑制肿瘤细胞存活，诱导细胞凋亡实现的[84]。Cao等[85]研究发现，酸枣仁中黄酮类成分可以通过抑制锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和FoxM1的表达，从而降低肝癌干细胞样细胞（HCSLC）的致癌性，并且显著抑制携带HCSLC裸鼠的肿瘤生长。以上研究表明酸枣仁中黄酮类成分具有显著抗肿瘤活性，对其作用机制的深入研究可为抗肿瘤药物开发奠定基础。

4.6 其他方面

近年来酸枣仁中黄酮类成分在其他方面的生理活性也有研究，如抑制黑色素、减轻糖尿病肾损伤、减缓骨质疏松、保肝等。研究发现，6'''-阿魏酰斯皮诺素可以抑制小眼相关转录因子（MITF）和酪氨酸酶表达、抑制总MITF磷酸化的MITF蛋白表达和抑制环磷酸腺苷（cAMP）介导的CREB磷酸化，通过cAMP-CREB-MITF轴转导从而抑制黑色素生成[86]。有研究表明，斯皮诺素在细胞和人类皮肤模型中都具有抑制黑色素的生物活性，其作用机制可能是通过与酪氨酸酶结合并竞争性抑制[87]。高群等[88]研究发现，酸枣仁黄酮可通过调节肾组织氧化应激与抗氧化系统的平衡失调，抑制肾细胞凋亡而减轻糖尿病大鼠的肾损伤，从而延缓糖尿病肾病进展。肖凤琴等[89]通过对全氟辛烷磺酸（PFOS）诱导的氧化性肝损伤小鼠模型研究发现，酸枣仁黄酮通过上调小鼠肝组织中Nrf2、HO-1 mRNA表达水平，发挥其保肝的药理活性。

5 结语

酸枣仁在中医中应用十分广泛，黄酮作为其主要活性成分，具有镇静安眠抗抑郁、改善记忆、抗氧化、抗肿瘤、保护心脏等多种药理活性，在药物、保健品、食品等领域的开发和研究都具有巨大潜力。尽管对于酸枣仁中黄酮类成分的提取工艺、分析方法、化学结构及生物活性方面研究较多，但在酸枣仁中黄酮类成分的剂型开发、药动学、生物化学合成等方面研究还不够深入。由于酸枣仁中黄酮类成分多样，发挥生物活性的成分复杂，可能是多种成分共同发挥某一种生物活性，也可能是一种成分发挥多种生物活性，因此，有必要对其成分和生物活性之间相互关系进行研究。