健脾和胃方对胃癌前病变大鼠NF-κB信号通路及细胞凋亡的作用❋

刘梅芬,何孙香△,吴中伟,梅耀国

(1.江西省九江市中医医院,江西九江 332000;2.九江学院化学化工学院,江西九江 332000)

胃癌是一种多发性消化道肿瘤,其在世界范围内所有恶性肿瘤中发病率及死亡率均排名靠前[1],在东亚等发展中国家尤甚[2]。伴随我国老龄化进程加快,胃癌发病率还将持续增长[3],给社会带来了巨大的压力。胃黏膜正常细胞发展为癌细胞之前的病变过程被称为胃癌前病变[4]。干预和阻断胃癌前病变对预防胃癌有重要临床意义,能有效降低胃癌发病率[5-6]。胃癌前病变在中医症状上表现为胃脘痛、反胃、痞满、痰浊,中医认为其发展过程与脾胃肝等脏腑功能失调相关。目前对于胃癌前病变西医治疗手段尚不完善,相较之下,中医治疗具有明显优势,能明显减轻胃癌前病变患者的临床症状。相关临床研究表明,健脾和胃方能够保护胃黏膜,增加胃肠动力,促进胃排空,有助于调节胃功能[7]。本研究从核因子(nuclear factor kappa-B,NF)-κB与细胞凋亡的关系探讨疏肝健脾和胃方对胃癌前病变大鼠的干预作用及机制,以期为中医药早期干预胃癌进展提供实验依据。本研究已通过江西省九江市中医医院动物伦理委员会审批,编号:20200816。

1 材料与方法

1.1 动物

50只SPF级雄性Wistar大鼠,体质量(220±20)g,由中山康方生物医药有限公司提供,动物许可证号:SCXK(陕)2012-003。于西安交通大学医学部实验动物中心适应性饲养1周,温度20 ℃、湿度60%,常规饲料,自由饮水。

1.2 主要试剂与仪器

N-甲基-N-硝基-亚硝基胍(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)购自上海澣香生物科技有限公司(货号:70-25-7);苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染液购自北京索莱宝科技有限公司(货号:G1120);白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-4、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-αELISA检测试剂盒购自武汉恩菲生物科技有限公司(货号:ERB0062、ECH0044、EM0183);二辛可宁酸(Bicinchonininc acid,BCA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(货号:AR016)电化学发光(Electro chemi luminescence,ECL)试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司(货号:HR0338);细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-EGFP/PI双染)购自上海翊圣生物科技有限公司(货号:40302ES20);兔NF-κB单克隆一抗、兔Toll样受体(toll-like receptor,TLR)-4单克隆一抗、兔半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-3单克隆一抗、兔B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)单克隆一抗、兔Bcl-2 基因相关X蛋白(BCL2-associated X)单克隆一抗、山羊抗兔多克隆lgG二抗购自英国Abcam公司(货号:ab32536、ab13556、ab32351、ab32503、ab32124、ab150077)。

XDS-900C型光学显微镜,上海蔡康光学仪器厂;GS-15R型离心机,美国Beckman公司;BIOBASE-EL10A型酶标仪,山东博科再生医学有限公司;KD-BM型包埋机、LEICA2016型切片机,德国Leica公司;ACEA NovoCyte3008流式细胞仪,美国ACEA Biosciences公司;DYY-12电泳仪,北京六一仪器厂;CFX型凝胶显影仪,美国Bio-rad公司;NanoDrop2000微量紫外可见分光光度计,购于美国Thermo公司。

1.3 分组与造模

50只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组、健脾和胃方低剂量组与健脾和胃方高剂量组,每组10只。适应性喂养1周后,除正常组外其余4组大鼠均构建胃癌前病变模型。

造模方法[8]:造模大鼠给予MNNG溶液(170 μg/mL)自由饮用配合MNNG溶液灌胃,灌胃剂量为1 mL/100 g,每3天灌胃1次,造模期间大鼠自由进食2 d后禁食1 d,每周随机时间对大鼠实行夹尾操作1次,使其处于被激怒状态,每次持续10 min。造模时间共12周。正常组大鼠以等量0.9%氯化钠溶液灌胃,正常喂养。造模第8周出现肠上皮化生,造模第12周出现异型增生提示造模成功。

1.4 给药方法

采用自拟健脾和胃方,药物组成为法半夏12 g,茯苓15 g,白术15 g,莪术10 g,太子参及丹参各20 g,由江西省九江市中医医院制剂室制备成健脾和胃方浸膏粉。成年人每日用量为12 g,按照成年人体质量为60 kg计算,大鼠的每日给药剂量为6.25 g/kg。健脾和胃方低、高剂量组每日给药剂量分别为4.5 g/kg、9 g/kg。采用购自上海长城药业有限公司的维甲酸(国药准字:H20010487),研细末,加蒸馏水配置成浓度为4 mg/mL的悬浊液。

造模成功后,健脾和胃方低、高剂量组大鼠分别给予相应浓度的健脾和胃方药液,以10 mL/kg[9]体积灌胃,2次/d,持续6周,阳性对照组大鼠以维甲酸悬浊液以10 mL/kg(4 mg/mL)灌胃,1次/d,持续6周,在此期间正常组及模型组大鼠灌胃等量的0.9%氯化钠溶液。

1.5 病理学观察

1.5.1 肉眼观察 给药结束后,各组大鼠均禁食1 d后,颈椎脱臼处死,留取大鼠胃黏膜组织,肉眼观察其病理状态并进行评分[10]。出血程度:无出血为0分,部分上皮点状出血为1分,小面积片状出血为2分,大面积片状出血为3分。炎症程度:无炎症为0分,轻度炎症为1分,中度炎症为2分,重度炎症为3分。糜烂程度,无糜烂为0分,上皮细胞表面破碎为1分,胃小凹上部破碎为2分,黏膜小凹下部破碎为3分[11]。

1.5.2 光镜下观察 取大鼠部分胃黏膜组织,经10%甲醛固定、石蜡包埋,切成4 μm厚度,采用HE染液染色,光学显微镜下观察胃黏膜组织病理情况。

1.6 指标检测方法

1.6.1 流式细胞术检测 取大鼠部分胃黏膜组织加适量0.9%氯化钠溶液制成匀浆,离心后弃上清,加入200 μL结合缓冲液,按照Annexin V/PI双染细胞凋亡试剂盒说明书操作,室温条件避光孵育0.5 h后,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6.2 ELISA检测 将大鼠胃黏膜组织加入0.9%氯化钠溶液制成匀浆,离心后取上清液,检测各组大鼠胃黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α。操作步骤根据ELISA试剂盒说明书进行。

1.6.3 Western blot检测 取大鼠部分胃黏膜组织并提取其总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,电泳,转膜,封闭,加入相应的一抗(NF-κB、TLR-4、Caspase-3、Bax、Bcl-2),稀释浓度均为1:1 000,第2天加入二抗(1:5 000),ECL法显色,Image J 1.53e软件分析条带灰度值,以目的条带与内参条带的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 健脾和胃方对大鼠体质量及胃黏膜病变的影响

如表1所示,与正常组比较,模型组大鼠体质量明显降低(P<0.05);与模型组比较,健脾和胃方低、高剂量组及阳性对照组大鼠体质量均有不同程度增长(P<0.05),其中健脾和胃方高剂量组大鼠体质量最高。与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜出血程度、炎症程度及糜烂程度均明显增加(P<0.05);与模型组比较,健脾和胃方低、高剂量组及阳性对照组大鼠胃黏膜出血程度、炎症程度及糜烂程度均有所改善(P<0.05)。

表1 各组大鼠体质量及胃黏膜病变情况比较

2.2 健脾和胃方对大鼠胃黏膜组织病理的影响

正常组大鼠胃黏膜组织没有缺损、厚度适中,上皮细胞组成规律,无脱落现象;模型组大鼠胃黏膜组织出现明显破损且厚度变薄,上皮细胞排列无序,有明显的细胞脱落及坏死现象;健脾和胃方低、高剂量组及阳性对照组大鼠胃黏膜组织病理情况得到明显改善(见图1)。

2.3 健脾和胃方对大鼠胃黏膜组织细胞凋亡的影响

如图2、表2所示,与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜组织细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。与模型组比较,健脾和胃方低、高剂量组及阳性对照组大鼠胃黏膜组织细胞凋亡率均明显上升(P<0.05)。

图2 各组大鼠胃黏膜组织细胞凋亡率比较

表2 各组大鼠胃黏膜组织细胞凋亡率比较

2.4 健脾和胃方对大鼠胃黏膜组织炎症因子水平的影响

如表3所示,与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明显上升(P<0.05)。与模型组比较,健脾和胃方低、高剂量组及阳性对照组大鼠胃黏膜炎症因子水平均不同程度降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠胃黏膜组织炎症因子水平比较

2.5 健脾和胃方对大鼠胃黏膜组织相关蛋白表达的影响

如图3、表4所示,与正常组比较,模型组大鼠胃黏膜组织NF-κB、TLR4、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,健脾和胃方低、高剂量组及阳性对照组大鼠胃黏膜组织NF-κB、TLR4、Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。

注:核因子κB(NF-κB),Toll样受体(TLR),半胱氨酸蛋白酶(Caspase),B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2),Bcl-2 基因相关X蛋白(Bax)

表4 各组大鼠胃黏膜组织NF-κB、TLR4、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白比较

3 讨论

具有癌变可能的疾病被称为癌前病变。胃癌前病变包含胃黏膜上皮组织异常增生、肠上皮化生、慢性萎缩性胃炎等[12]。干预和阻断胃癌前病变能够有效抑制胃癌发展,降低胃癌的发病率和死亡率[13]。中医学认为,胃癌的根本原因在于饮食不当和情志不调,致使脾胃功能失调,进而引发痰浊、水湿和血瘀等病理变化,最终导致胃黏膜细胞发生癌变。中医药防治胃癌前病变具有明显的优势,健脾和胃方具有补脾益气、濡养胃阴的功效,其疗效已在临床实践中得到验证。目前,维甲酸也被广泛应用于逆转胃癌前病变的治疗且疗效较好,然而过量使用有发育异常和致畸风险。本研究以维甲酸为阳性对照药,探讨健脾和胃方对胃癌前病变大鼠的作用机制。

临床观察发现,胃癌前病变常伴随慢性萎缩性胃炎的发生,慢性炎症也对癌症的进展产生影响[14]。NF-κB信号通路在机体炎症反应过程中发挥着重要调控作用,已证实NF-κB信号参与到许多炎症反应的进程中,调控许多炎症基因的表达,已被广泛认为是调节炎症相关疾病的主要信号通路,是炎症反应过程中的关键因子。NF-κB通路被激活后可促使其下游靶蛋白TLR4转录,而TLR4能够加速炎症反应及癌症的发展进程,该过程伴随大量炎症因子异常表达[15],炎症反应本身是机体的免疫防御机制,但过于强烈的免疫炎症反应反而会对机体产生病理性伤害,使疾病的发展恶化[16-17]。本次研究结果表明,相较模型组,健脾和胃方低、高剂量处理组大鼠胃黏膜组织的炎症因子、NF-κB、TLR4水平均有不同程度下降,提示健脾和胃方则能有效缓解该炎症反应,可能通过抑制NF-κB通路激活,下调免疫受体TLR4的表达有关。此外,胃癌前病变与细胞凋亡密切相关。NF-κB通路也是参与细胞凋亡调控的重要通路,正常情况下NF-κB以二聚体形态存在于细胞质中并处于失活状态,当受到细菌或病毒刺激后会被激活,并以激活状态进入细胞核刺激靶基因转录,影响细胞凋亡。熊见等[18]对胃癌组织病变过程中细胞凋亡情况及凋亡基因进行分析比较,发现促癌蛋白过度表达、抗凋亡蛋白则表达下降,组织细胞凋亡率明显降低,从而促进胃癌发展。卫华等[19]分别对胃癌前病变胃镜活检标本及胃癌手术标本进行检测,证实随着病情逐渐加重,细胞凋亡抑制率逐渐增加。本次研究结果表明,与模型组比较,健脾和胃方低、高剂量组大鼠胃组织病理变化明显改善,NF-κB、TLR4水平均降低(P<0.05),细胞凋亡率升高,提示健脾和胃方能有效促进胃癌前病变大鼠胃黏膜组织细胞凋亡,可能通过抑制NF-κB通路激活,下调免疫受体TLR4的表达有关。NF-κB通路可通过调控细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达参与到细胞凋亡的过程当中[20]。Bcl-2和Bax属于癌基因家族和Bcl-2蛋白家族,分别能够抑制和促进细胞凋亡,发挥重要的调节作用在细胞凋亡的调控发展中起到重要的调节作用。同时,Bcl-2启动子上存在NF-κB的特异性结合点,NF-κB可经过转录的途径直接影响并上调Bcl-2的表达,也可以通过其他途径促进Bcl-2表达,抑制NF-κB活性能造成Bcl-2表达的抑制,进而诱导肿瘤细胞凋亡。本次实验研究表明不同浓度健脾和胃方汤剂处理组大鼠胃黏膜组织病变程度有明显好转,相较模型组,健脾和胃方低、高剂量处理组大鼠胃黏膜组织NF-κB、Caspase-3、Bax蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高,表明健脾和胃方对胃癌前病变有明显治疗功效。健脾和胃方可以通过下调NF-κB蛋白表达,抑制NF-κB通路激活,影响Bcl-2/Bax的表达,从而调控胃癌前病变细胞凋亡,影响胃癌前病变的发生发展进程。

综上所述,健脾和胃方治疗MNNG引起的胃癌前病变疗效明显,治疗过程可能与抑制NF-κB通路激活,促进细胞凋亡、抑制炎症反应有关,但由于本次实验仅通过动物实验观察,所用大鼠模型与人类的生物节律特点存在一定差异,因此仍需进一步临床实验验证,为健脾和胃方治疗胃癌前病变的作用机制提供依据。