FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2联合诊断胃癌的临床价值及机制研究

徐雪莹,章 燕,钟 峰,叶 开,唐晓磊

(皖南医学院第二附属医院 1.检验科;2.医学转化中心,安徽 芜湖 241000)

胃癌是全球第三大致死性恶性肿瘤,每年新增病例超过100万[1]。由于胃癌早期缺乏明显及特异性的临床症状,大多数患者在确诊时已经处于晚期,往往错过根治性切除的机会,或存在术后转移和复发的高风险[2]。因此,提高胃癌早期诊断率已成为当今临床亟需解决的问题。

大量研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤患者组织及体液中异常表达,并参与调控癌症的发生发展[3]。Tong等研究发现lncRNA在血浆中能够稳定存在,使其可以用作肿瘤诊断及预后判断的标志物[4-5]。于纯良等发现PIK3CA等循环肿瘤DNA在胃癌患者外周血中的检出率高于胃癌组织,为胃癌患者的精准靶向治疗提供了依据[6]。本研究筛选并分析了3种lncRNA联合诊断胃癌的临床价值,并选择HOXC-AS2进行下游靶基因预测以及PPI蛋白互作分析,构建HOXC-AS2-miRNA-mRNA调控网络,以期为胃癌的早期诊断提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 数据下载 从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中下载胃癌的RNA-seq测序数据及患者相关临床信息,其中包括肿瘤样本375例,正常样本32例。从基因表达综合(GEO)数据库中下载GSE184336(230例配对的胃癌/正常胃组织)和GSE179252(38例配对的胃癌/正常胃组织)数据集。

1.2 患者样本 收集2020年9月～2021年11月于皖南医学院第二附属医院就诊的胃癌患者50例,男35例,女15例,年龄46～88岁,中位年龄64岁。纳入标准:①经组织切片病理检查确诊为胃癌;②纳入前均未进行手术、放化疗及其他辅助治疗等;排除标准:排除糖尿病、严重肝肾功能不全、感染、血液系统疾病或其他恶性肿瘤疾病患者。收集同期年龄和性别匹配的胃良性疾病(胃炎、胃溃疡等)患者和健康体检者各50例。本研究经皖南医学院第二附属医院伦理委员会批准,患者均知情同意。

1.3 血清样本采集及处理 采集各研究对象治疗前(健康体检者于体检时)空腹静脉血2 mL,4℃、3 000×g离心10 min分离血清,4℃、12 000×g离心10 min以去除细胞碎片,血清分装后置于-80℃保存。

1.4 RNA提取及qRT-PCR反应 按miRNeasy Serum/Plasma kit(美国Qiagen公司)说明书提取血清总RNA,利用逆转录试剂盒(美国Qiagen公司)将RNA逆转录为cDNA。根据2×SYBR Green PCR Master Mix(北京康为世纪公司)说明书配置反应体系,采用ABI 7500荧光定量PCR检测系统(美国ABI公司)进行分析。qRT-PCR条件:95℃预变性15 min;94℃ 20 s,55℃ 20 s,72℃ 20 s,共40个循环。以U6为内参,采用-ΔCt值表示lncRNA相对表达量。ΔCt=样本Ct目的基因-样本Ct管家基因。利用Primer Premier 5.0软件设计引物,并由苏州金唯智公司合成,引物序列见表1。

表1 各基因引物序列及产物大小

1.5 数据处理 使用R语言的limma包分析相对于癌旁正常组织,胃癌组织中失调的lncRNA,以|log2FC|>2和P<0.05为条件筛选差异表达的lncRNA。LncBase和miRDB数据库预测HOXC-AS2下游靶基因。String数据库分析蛋白之间的相互作用,通过Cytoscape 3.9.1软件绘图。

1.6 诊断模型建立及评估 以TCGA-STAD、GSE179252、GSE184336数据集和本院患者的样本为研究对象,所选lncRNA表达水平作为自变量,将组织/血清是否来源于胃癌定义为因变量,进行二分类Logistic回归分析得到回归方程,算得联合检测的预测概率值并绘制受试者工作特征(ROC)曲线判断其诊断价值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0及Graphpad Prism 7.0统计软件进行分析,计量资料采用F检验(两两比较q检验)分析受检者血清中所选lncRNA的表达差异,并采用二分类Logistic回归分析建立诊断模型。采用等级相关系数分析lncRNA表达与临床病理参数相关性。采用ROC曲线分析所选lncRNA单独及三者联合检测胃癌的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选差异表达的lncRNA 与癌旁正常组织相比,胃癌组织中有1 518个基因表达失调,包括145个上调lncRNA和66个下调lncRNA,见图1。

A.热图列出前100个基因;B.火山图。

2.2 建立lncRNA诊断模型 对211个差异表达的lncRNA进行ROC曲线分析,选取ROC曲线下面积(AUC)>0.95的3个基因——MIR4435-1HG、FOXD2-AS1和HOXC-AS2进行后续分析(表2)。

表2 差异表达的lncRNA ROC分析结果

2.3 FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2单独及联合检测胃癌的诊断价值 在TCGA-STAD数据库中,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2单独检测均表现出较高的灵敏度和特异度,三者联合检测的AUC为0.994,灵敏度98.4%,特异度100%。在GSE179252和GSE184336数据集中,三者联合检测也表现出较好的诊断效能,AUC分别为0.958和0.921,灵敏度、特异度分别达到89.5%、97.4%和83.1%、93%,见表3及图2。

表3 各数据库中lncRNA联合检测的诊断效能

图2 FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2单独及联合检测诊断胃癌的ROC曲线

A.F=18.996,P<0.001;B.F=24.685,P<0.001;C.F=16.137,P<0.001。

2.4 FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2联合检测在血清中的诊断价值 进一步验证3个lncRNA在血清中的诊断效能。结果显示,与健康体检者相比,MIR4435-1HG在胃良性疾病患者血清中表达上调(P<0.05),FOXD2-AS1和HOXC-AS2在两组研究者中表达量差异无统计学意义(P>0.05)。相较于胃良性疾病患者,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2在胃癌患者血清中表达升高P<0.001)。Logistic回归分析得到联合检测回归方程为:Logit(P)=7.3+0.587×FOXD2-AS1+0.384×MIR4435-1HG+0.121×HOXC-AS2,见表4。三者联合检测的AUC为0.843,灵敏度和特异度分别为80%和86%,见表5。

表4 lncRNA联合检测的Logistic模型参数

表5 lncRNA联合检测在血清中的诊断效能

2.5 HOXC-AS2与胃癌患者临床病理参数相关性 在TCGA-STAD数据库中,HOXC-AS2与胃癌患者年龄、性别、T分期、N分期、M分期、TNM分期相关性均无统计学意义(P>0.05);与肿瘤分级相关(P<0.05),见表6。

2.6 HOXC-AS2下游靶基因预测 LncBase和miRDB数据库预测结果显示HOXC-AS2可与下游mRNA竞争性结合miR-9-5p、miR-675-5p、miR-27a-5p、miR-148a-3p、miR-148b-3p、miR-139-5p、miR-1180-3p位点,从而调控胃癌进展(图4)。

2.7 PPI蛋白互作分析 String数据库分析结果显示DLX6与HOXC家族之间的相互作用关系共同构成了HOXC-AS2相关蛋白互作网络(图5)。

图5 HOXC-AS2潜在靶基因编码蛋白质的PPI网络

3 讨论

近年来,lncRNA作为癌症早期筛查、诊断、判断预后和监测药物治疗效果的生物标志物已引起广泛关注[7-8]。研究表明,lncRNA-LET、PVT1、PANDAR、PTENP1和LINC00963的联合检测可作为诊断肾透明细胞癌及其预后评价的有效生物标志物[9]。陈勇等发现Lnc01317和Lnc00886在胃癌患者血液中低表达,其作为诊断标志物的AUC分别为0.823和0.743,灵敏度、特异度为75%、86.7%和55%、90%[10],。然而,仍有许多在胃癌中异常表达的lncRNA可能因AUC值过低无法区分胃癌患者与健康体检者,从而限制了其临床应用。因此,发现具有更高灵敏度和特异度的lncRNA及其联合检测用作胃癌诊断的生物标志物非常重要。

本研究在TCGA数据库中筛选出3个在胃癌中差异性表达的lncRNA——FOXD2-AS1、MIR4435-1HG、HOXC-AS2。三者联合检测胃癌的AUC为0.994,灵敏度98.4%,特异度100%。在GSE184-336和GSE179252数据集中,三者联合检测也表现出较好的诊断效能,AUC分别为0.921和0.958,灵敏度、特异度分别达到83.1%、93%和89.5%、97.4%。进一步验证FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2在50例胃癌患者、胃良性疾病患者及健康体检者血清中的表达水平,结果与胃癌组织中的表达一致,三者联合检测的AUC为0.843,灵敏度和特异度分别为80%和86%。以上结果表明,FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2 三者联合检测能够较好地区分胃癌与非胃癌患者,具有较强的特异诊断价值。

已有研究表明FOXD2-AS1在骨肉瘤、胃癌、宫颈癌、喉癌等多种肿瘤中表达上调,与患者的不良预后密切相关[11-14]。黄振华等发现MIR4435-1HG在胃癌患者血清中呈高表达,且与淋巴结转移、浸润深度和TNM分期相关[15],Gao等发现MIR4435-1HG分子通过调控miR-138-5p/Sox4轴抑制胃癌细胞的侵袭、迁移和EMT过程[16]。然而对于HOXC-AS2的研究甚少,因此选择HOXC-AS2进行后续分析。结果发现HOXC-AS2在胃癌组织中表达上调,其表达量与胃癌患者的肿瘤分级相关。研究发现HOXC-AS2主要定位在子宫内膜癌和胶质瘤细胞的胞质中[17-18],同时越来越多的证据表明胞质中的lncRNA可作为ceRNA分子吸附miRNA从而发挥其保护下游靶基因的功能[19]。通过预测与HOXC-AS2位点互补结合的miRNA发现,HOXC-AS2可发挥分子海绵作用与下游mRNA竞争性结合miR-9-5p、miR-675-5p、miR-27a-5p、miR-148a-3p等位点,调控DLX6与HOXC蛋白家族之间的相互作用,从而加速胃癌进展。

综上所述,血清中的FOXD2-AS1、MIR4435-1HG和HOXC-AS2可用作胃癌检测的新型诊断标志物,3种lncRNA联合检测可以提供足够高的诊断准确性,为胃癌的早期诊断提供实验室依据。同时,生物信息学分析显示HOXC-AS2可作为ceRNA促进胃癌进展,后续可通过实验进一步验证。