基于多光谱成像技术鉴别不同紫花苜蓿品种的种子

倪浩然,王 润,胡 昊,刘俊泽,田沛鑫,贾善刚

(中国农业大学草业科学与技术学院,北京 100193)

多光谱成像(Multispectral imaging,MSI)技术是一种新型的分析检测技术,它将空间成像系统和光谱探测系统相结合,能够同时获取被测物的光谱和空间信息。该技术具有简便易行、使用可靠、成本较低等优点,且不会对被测物造成破坏[1-3]。归一化标准判别分析(Normalized canonical discriminant analysis,nCDA)是一种基于MSI变换的监督变换构建方法,能够将图像分割成具有不同光谱特征的感兴趣区域,当两个不同品种具有不同的光谱特征时,在nCDA变换后的图像中,它们会表现为两个不同的感兴趣区域,更便于解释和分割,以便进行后续数据分析[1]。Shrestha等[4]使用nCDA对11个番茄(SolanumlycopersicumL.)品种进行配对判别,正确识别率达到100%,只有少数几个品种的识别率低于85%。王雪萌等[5]采用多光谱成像的无损检测方法,成功地对紫花苜蓿硬实种子和非硬实种子进行了识别,准确率高达96.8%～99.0%。

抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)又称维生素C,化学名为L-苏糖型-六-2-烯醇-1内酯[6],植物体内有效的抗氧化剂和自由基清除剂,参与植物体内许多物质代谢和氧化还原反应,可以减少膜脂过氧化对细胞造成的伤害[7-10]。国内外许多研究表明,AsA有利于种子的萌发。如尚瑞广等[11]发现,300 mg·L-1AsA处理的玛咖(LepidummeyeniiWalp.)陈种子发芽率最高。Dolatabadian等[12]发现AsA对向日葵(HelianthusannuusL.)和油菜(BrassicanapusL.)种子萌发有显著的促进作用。Zhao等[13]研究发现0.1 mmol·L-1AsA通过抑制过量的ROS产生、降低离子毒性和上调抗氧化系统来促进紫花苜蓿种子的萌发和诱导耐盐性。

紫花苜蓿(Medicagosativa)为多年生豆科牧草,具有营养价值高、产量高、适应性好、抗逆性强等特点[14-15],在我国农业、畜牧业发展和生态环境保护中发挥着重要的作用[16],被称为“牧草之王”[17]。目前,国内外使用多光谱技术来进行牧草种子尤其是紫花苜蓿种子品种区分的研究较少,且AsA含量与种子的多光谱参数间是否存在一定的关联还未知。因此,本研究利用多光谱技术对25个不同紫花苜蓿品种的种子形态特征和光谱特征进行采集,同时结合nCDA算法,对不同品种种子的形态特征和光谱特征进行了分析,以期为多光谱成像技术在牧草品种识别领域的推广应用提供一些思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

25个紫花苜蓿品种分别为：WL系列品种‘298’‘319’‘343’‘349’‘354’‘358’‘363’‘377’‘440’‘525’和‘712’,以及‘阿尔冈金’‘东苜2号’‘甘农1号’‘甘农9号’‘公农1号’‘惊喜’‘可汗’‘龙牧803’‘龙牧806’‘苜丰’‘中草3号’‘中兰2号’和‘中苜1号’。WL系列种子由北京正道种子公司惠赠,其它苜蓿种子由育种单位与代理公司提供,或本实验室保存。

1.2 多光谱信息采集

使用多光谱成像仪VideometerLab(Videometer A/S,Herlev,Denmark)来进行种子图像信息的采集[18]。

在获取种子的RGB图像后,导出种子形态特征数据,包括面积(Area)、长度(Length)、宽度(Width)、长宽比(RatioWidthLength)、紧实度圆(Compactness Circle)、形状参数(BetaShape)、颜色参数(CIELab)、饱和度(Saturation)、色调(Hue)等指标;然后在“statistic”模块中导出种子的光谱特征数据,包括从种子图像像素中计算的19个波长反射光的平均反射率[19]。

1.3 多光谱数据分析

利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder将形态特征差别最大的‘阿尔冈金’和‘WL377’分别标记为红色和蓝色,以此作为标准,依次输出其余23个紫花苜蓿品种的nCDA图像。

使用R语言中的factoextra包来进行k-means聚类分析。

1.4 发芽率与AsA含量测定与特征参数分析

各品种均采用纸上发芽,将种子以10×10摆放在发芽盒上,每个品种3次重复。参照《草种子检验规程发芽试验》GB/T 2930.4-2017[20]进行操作,将培养箱温度设置为恒温20℃,模拟正常光照条件,发芽第10天测定发芽率。

种子发芽率=(末次计数时全部正常发芽粒数/供检种子数)×100%。

使用苏州科铭生物技术有限公司提供的还原型AsA含量测定试剂盒进行AsA含量的测定。

1.5 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 26进行单因素方差分析(One-way ANOVA),使用R语言中的heatmap函数来绘制特征参数相关性热图。

2 结果与分析

2.1 不同品种紫花苜蓿种子的多光谱形态与光谱特征分析

利用不同品种种子的多光谱形态与光谱特征参数,绘制25个品种种子的折线图(图1)。选取差异较大的4个形态参数,进行25个品种的比较,结果显示,与其他各品种相比,品种‘WL298’的饱和度、颜色参数A和颜色参数B差异较大,而其余各品种间也有一定区别(图1a)。随着波长的增加,光谱反射率呈上升趋势,其中品种‘WL298’在365,405和430 nm三个波长下的光谱反射率与其他品种相比差异较大(图1b)。其余各品种在各个波长下的光谱反射率也显示出一定差异。

图1 不同品种种子的多光谱形态与光谱特征参数Fig.1 MSI morphology and spectral data for seeds of 25 different varieties注：(a)不同品种紫花苜蓿种子的形态特征参数,从中选取颜色参数L、颜色参数A、颜色参数B、饱和度绘制折线图;(b)不同品种紫花苜蓿种子的光谱特征参数Note：(Panel a) Morphological data for different alfalfa varieties seeds,“CIELab”and “Saturation”were selected;(Panel b) Spectral data for different alfalfa varieties seeds

2.2 不同品种紫花苜蓿种子的特征参数聚类分析

利用形态特征参数进行聚类,结果显示6个国外WL系列品种(‘WL525’‘WL354’‘WL712’‘WL366’‘WL363’‘WL377’)被归为一类(II),第Ⅲ类也偏向于国外品种。而品种‘WL298’被单独归为一类(I),这显示其形态上的显著不同(图2a)。第Ⅳ类包括10个偏向于国内的品种。利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder输出nCDA图像,可以看到‘WL298’‘WL525’‘WL354’‘WL712’‘WL366’‘WL363’‘WL377’这几个品种均显示为均匀的蓝色,其中品种‘WL298’的蓝色则最为均匀,红黄色种子则偏向于集中在第Ⅲ类和第Ⅳ类。

图2 基于形态和光谱特征参数的聚类分析Fig.2 K-means clustering of morphological and spectral data注：(a)基于多光谱形态参数的聚类分析树状图,外圈为各品种对应的nCDA图像;(b)基于光谱特征参数的聚类分析树状图,外圈为各品种对应的RGB图像Note：(Panel a) K-means clustering of morphological data,the outer is the nCDA images corresponding to the tested individual varieties;(Panel b) K-means clustering of spectral data,the outer is the RGB images corresponding to the tested individual varieties

基于光谱特征进行聚类分析,结果显示从‘惊喜’到‘龙牧806’的18个品种被归为一大类(III),‘品种WL298’被单独归为一类(I)。虽然基于形态聚类结果没有将一些品种区分开,如品种‘WL349’和‘甘农1号’‘东苜2号’,但是它们在光谱聚类中能够区分。这说明,结合形态参数和光谱参数,可以将本实验25个品种区分开。此外,除品种‘WL298’外,各品种种子的RGB图像差别不大,无法从肉眼上进行区分。

2.3 不同品种紫花苜蓿种子的发芽结果与AsA含量

比较各品种种子发芽率,我们发现有14个品种的发芽率都在90%以上,仅有‘阿尔冈金’的发芽率低于80%(图3a)。经过相关性分析后发现,发芽率与各个参数间的相关性很低。

比较各品种种子的AsA含量,发现品种‘WL363’的AsA含量最高,为1 856.15 mg·g-1,‘苜丰’的AsA含量最低,为845.41 mg·g-1(图3b)。

图3 不同品种发芽率及AsA含量Fig.3 Germination rate and AsA content of 25 different varieties注：(a)各品种紫花苜蓿种子正常萌发第十天发芽率;(b)各品种紫花苜蓿种子AsA含量。不同小写字母表示差异显著(P<0.05)Note：(Panel a) Germination rate for different alfalfa varieties seeds on the tenth day;(Panel b) AsA content of alfalfa seeds of different varieties.Different lowercase letters indicate a significant difference at the 0.05 level

2.4 特征参数相关性分析

对AsA含量和形态、光谱特征参数分别进行相关性分析,绘制出参数相关性的热图(图4)。AsA含量与形状参数a、形状参数b、长宽比以及紧实度呈一定的负相关关系,相关系数分别为-0.59,-0.58,-0.67,-0.68,而与其余形态特征参数则有一定的正相关关系,但相关性较弱(图4a)。另外,各个形态参数之间存在一定的相关性,在热图中大致分为三个区域。与此同时,AsA含量与光谱特征参数的相关性较弱,而各波长下的光谱反射率之间存在一定相关性,也同样被分为三个区域(图4b)。

图4 特征参数相关性分析热图Fig.4 Heat map for correlation analysis注：(a)AsA含量与形态特征参数相关性分析热图;(b)AsA含量与光谱特征参数相关性分析热图Note：(Panel a) Heat map for correlation analysis between AsA content and morphological data;(Panel b) Heat map for correlation analysis between AsA content and spectral data

3 讨论

种子因外表氧化,不同储存年限的种皮颜色会呈现一定区别,年份较远的种子会因为氧化问题而颜色变暗,失去光泽,从而饱和度降低[21]。这可能是导致‘WL298’饱和度低于其他品种的原因。此外,CIELab颜色参数是一种由国际照明委员会推荐的用于检验颜色的指标,其中L*表示亮度,a*表示由绿到红,b*表示由蓝到黄[22]。该参数可以区分人眼不能察觉的颜色变化,从而消除视觉上的主观性[23]。在本研究中,‘WL298’的CIELab a*和CIELab b*与其他品种相比差别较大,与输出的RGB图像结果基本一致。而其余各品种的形态参数特征差别不明显,用肉眼也无法对他们进行区分。在光谱特征方面,品种‘WL298’在365～450 nm波长下的光谱反射率高于其他品种,也极有可能是由于种皮颜色变灰、变白导致的[24]。

基于形态特征的聚类分析显示,大多数的来自国外的紫花苜蓿WL品种(‘WL354’‘WL363’‘WL366’‘WL377’‘WL525’‘WL712’)被归为一类,说明这几个品种在形态特征上的相似度极高。另外第Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ类偏向于国外品种,第Ⅳ类偏向于国内品种,说明国外品种与国内品种在形态特征上存在一定区别,以‘WL377’和‘阿尔冈金’为标准输出的nCDA图像也同样说明了这一观点。此外,不管是基于形态特征参数还是基于光谱特征参数,结果显示‘WL298’都被单独聚为一类,且它的RGB图像也与其他品种具有较大差别,可以通过肉眼观察得到,这个结果从一定程度上说明了利用多光谱成像技术对于特征差别较大的品种的区分比较准确。因此,以上结果表明利用多光谱成像技术来对不同品种进行鉴别具有一定的效果。

许多研究表明,外源施加AsA能够提高种子在逆境条件下的发芽率[25-30]。对不同苜蓿品种的发芽率与其内在AsA的含量进行了测定,结果显示两者相关性不强,可能是由于各种子贮藏年限不尽相同所导致的。对不同品种的种子内在AsA含量和形态、光谱特征参数进行了相关性分析,结果显示AsA含量与部分形态特征参数的相关性大于与光谱特征参数的相关性。在植物中,AsA由L-半乳糖通过Smirnoff-Wheeler途径合成[31]。Mario等[32]的研究表明,AsA浓度与组织类型和环境密切相关,尤其是光照强度。但是对AsA含量与种子多光谱形态、光谱特征参数是否有关联的研究甚少。在形态特征参数中,形状参数a表示通过多光谱成像仪获取种子图像后计算并输出β椭圆拟合的参数a,对应于种子形状中最尖锐部分的宽度;而形状参数b则对应最粗钝部分的宽度[19]。紧实度圆代表种子面积与相同长度的圆的面积之比。本研究的结果显示AsA含量与种子的形状参数a、形状参数b、长宽比以及紧实度圆有一定的负相关关系,且相关性较强,但具体原因仍不清楚,后续可以进行深入研究。

不同品种的牧草种子在肉眼上难以区别,传统的对于品种进行鉴别的方法通常包括蛋白质指纹图谱鉴定和化学鉴定法等[33-34]。这些方法主要是基于种子的化学、物理以及生物学特性来进行鉴定[35],但是往往耗费时间长、成本高,而且这些方法会破坏种子的完整性。王芳等[36]利用太赫兹时域光谱(THz-TDS)技术对豆科牧草种子进行鉴定识别,结果表明该技术结合统计分析方法可以作为无损鉴定牧草种子真伪和识别牧草种子种类的一种有效手段,但该技术目前缺少一个标准数据库。骆坤兰[37]建立了基于高光谱成像技术的甜瓜(CucumismeloL.)种子识别模型,识别准确率达98%以上,但高光谱成像技术成本较高。因此,对于种子行业来说,发展一种通量高、无损、省时、成本低且准确率高的检测技术极为重要,本研究的结果表明,多光谱成像检测技术的应用将是一个极具潜力的发展方向。

4 结论

利用多光谱成像技术,结合形态和光谱特征参数,能够在一定程度上将不同品种的牧草种子区分开,因此具有很大的研究潜力。此外,种子抗坏血酸含量与部分形态特征参数存在一定的相关性,后续可以对相关机理进行更深入的研究。