河西冷凉地区芍药根腐病病原鉴定及室内药剂筛选

杨克泽， 吴芳， 魏玉杰， 汪亮芳， 常浩，吴之涛，2， 杨宪忠，2

（1.甘肃省农业工程技术研究院，甘肃省特种药源植物种质创新与安全利用重点实验室，甘肃 武威 733006；2.武威市祁连山区道地中药材生态栽培技术创新中心，甘肃 武威 733006）

芍药（Paeonia LactifloraPall.）是芍药科芍药属著名草本花卉，不仅有极高的观赏价值，而且有非常重要的药用价值。河西冷凉地区因具有独特的地理优势与气候条件，适合种植芍药，主要分布在武威市古浪县古丰镇柳条河与黄羊川镇、金昌等地区。近年来，芍药种植面积逐年增加，市场前景非常广阔。在芍药产业发展过程中，其病虫害问题日益增多，且危害越来越严重，不仅降低了芍药的产量，还严重影响了其观赏价值和药用价值等。

目前，河西冷凉地区芍药的主要病害种类有白粉病、根腐病、褐斑病等[1-2]，其中根腐病是为害芍药根部最严重的病害[3-5]。因此，本研究针对河西冷凉地区芍药病害情况展开调查研究，对引起芍药根腐病的病原菌进行分离和形态鉴定，同时开展室内药剂筛选试验，针对芍药病害的病原、发病规律、危害症状进行分析，为河西冷凉地区芍药根腐病的田间防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

芍药根腐病病株采自甘肃省武威市凉州区黄羊镇新镇路的甘肃省农业工程技术研究院芍药种植基地（N 37°67′35″，E 102°85′32″）。

3%苯醚甲环唑悬浮剂购自先正达南通作物保护有限公司，30%丙硫菌唑可分散性悬浮剂购自通州先正大农药化工有限公司，24%噻呋酰胺悬浮剂购自北京燕化用生生物有限公司，50%多菌灵可湿性粉剂购自深圳诺普信公司，43%戊唑醇悬浮剂购自上海生农生化制品有限公司，20%氟唑菌酰羟胺悬浮种衣剂购自先正达投资有限公司，43%氟菌肟菌脂悬浮剂购自拜尔有限公司，25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂购自先正达南通作物保护有限公司，30%肟菌戊唑醇悬浮剂购自拜尔有限公司，10%叶菌唑悬浮剂购自安徽久易有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芍药根腐病病原菌的分离和致病性测定采集的芍药根腐病病株逐个记录发病症状。采用常规组织分离法[6]样品中的病原菌进行分离培养，将培养后的菌株稀释纯化进行单孢分离，获得单孢进行纯培养。将在芍药根腐病株中分离到的频率较高的菌落，根据柯赫氏法则[7]验证分离物的致病性。选择健康芍药植株，栽植前剪去过长的根系，将根部放入0.1%的升汞液中浸泡3 min后取出，用无菌水清洗干净，移栽到装有基质（110 ℃烘箱中高温消毒）的花盆中，浇水后放入设施大棚中缓苗；缓苗后，准备1×107个·mL-1的孢子悬浮液进行灌根接种，灌根前刺伤芍药根部，以灌无菌水作为对照。接种20 d 后进行调查，并取样带回室内进行再分离[8]。

1.2.2 芍药根腐病病原菌鉴定 形态鉴定：将确定了对芍药根部有致病性的单孢纯系菌落接种于PCA（马铃薯20 g、胡萝卜20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL）培养基，置于25 ℃黑暗培养5 d 后测定菌落直径并计算生长速度；10 d 后观察培养性状及色泽，并挑取少量菌丝制成临时玻片在显微镜下观测孢子、产孢细胞和分生孢子形态，同时进行显微拍照[9]。形态鉴定主要依据Leisle 分类系统并参照Booth和Burgess分类系统[10]。

分子鉴定：根据致病性测定和形态鉴定结果，选择代表性的菌株委托上海生工生物工程有限公司进行测序。扩增引物分别为ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) 和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，将测序获得的序列在NCBI 上通过BLAST 比对后，根据同源性对分离菌株与数据库中登录的近缘镰孢菌采用邻接法[11]构建系统发育树。

1.2.3 芍药根腐病病原菌室内药剂筛选 采用含毒介质法[12]进行室内药剂筛选试验，具体方法如下。分别量取50 mL PDA 培养基，装入250 mL 的三角瓶中进行高压灭菌，灭菌后冷却至50 ℃左右，分别量取5 mL 3%苯醚甲环唑悬浮剂、30%丙硫菌唑可分散性悬浮剂、24%噻呋酰胺悬浮剂、50%多菌灵可湿性粉剂、43%戊唑醇悬浮剂、20%氟唑菌酰羟胺悬浮种衣剂、43%氟菌肟菌脂悬浮剂、25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂、30%肟菌戊唑醇悬浮剂和10%叶菌唑悬浮剂加入装有PDA 培养基的三角瓶，摇匀后倒入90 mm的培养皿中；用消过毒的打孔器打取直径为6 mm的病原菌菌片，将其移入冷却后的PDA 平板中央，以加水作空白对照。每种药剂分别设置5个剂量处理（表1），每个处理重复4次。在25 ℃恒温箱中培养5 d，然后测量菌落直径（mm），计算菌丝生长相对抑制率（%）；以药剂浓度对数为横坐标(x)，相对抑制率的机率值为纵坐标(y)，用Microsoft Excel 软件绘制标准曲线，计算毒力回归方程、相关系数和抑制中浓度(EC50)，比较不同药剂的毒力。

表1 10种药剂的施用剂量处理Table 1 Dosage treatments of 10 Insecticides

1.3 数据分析

采用Excel 2010 进行数据整理和分析，采用MEGA 5 的邻接法（neighbor joining）构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 芍药根腐病发病症状

芍药发生根腐病后，根系腐烂，地上叶片出现褪绿或死亡，植株矮小。在根茎及其以下部位发病，老根发病较重，部分细根、新根也有感病。发病初期，根部产生不规则黑色或褐色病斑；然后病斑逐渐扩展并凹陷，至大部分根变黑腐烂，严重的根部全部腐烂、地上部分干枯全株死亡（图1）。

图1 芍药根腐发病症状Fig. 1 Symptom of root rot of Paeonia lactiflora

2.2 病原菌的形态特征

自芍药根部分离的病原物生长速率较快，在PDA 培养基上28 ℃培养5 d 后，菌落直径为6.6 cm。菌落正面呈白色絮状，菌丝放射状生长，绒状；菌落背面中心呈紫色，边缘呈白色（图2）。在PDA 培养基上培养，小型分生孢子数量较多，呈卵圆形或肾形，0~1 个隔膜，假头状着生在产孢细胞上，大小为(2.37~3.14) μm×(6.51~9.28) μm；大型分生孢子数量较少，呈镰刀状，较均匀，3~5 个 隔 膜，孢 子 大 小 为(3.99~4.74) μm×(22.60~45.94) μm（图3A 和B）；产孢细胞单瓶梗，较短（图3C）；厚垣孢子球形，表面光滑，单个或多个着生于菌丝间（图3D）。

图2 病原菌形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of pathogenic bacteria

图3 产孢细胞的形态特征Fig. 3 Morphological characteristics of sporogenic cells

2.3 致病性测定结果

用分离到的高频率菌株SY2020-2 的孢子悬浮液灌根接种，20 d后调查发现，芍药根部出现黑褐色病斑，病斑沿刺伤伤口处纵横扩展，而对照根部的刺伤处无病斑。取病健交接处进行再分离、纯化、培养并与接种菌株进行比较，菌落颜色以及孢子形态相似，故SY2020-2 对芍药根具有致病性（图4）。

图4 致病性测定Fig. 4 Pathogenicity determination

2.4 分子生物学鉴定结果

将SY2020-2 测序获得的微管蛋白序列在NCBI 上通过BLAST比对，根据同源性相似度对其与数据库中登录的近源菌株构建系统发育树，结果（图5）显示，SY2020-2 与登录号为MN417204.1（Fusariumoxysporum）和 MN417203.1（Fusarium oxysporum）聚为1 支。结合形态学特征，将菌株SY2020-2鉴定为尖孢镰孢菌（Fusariumoxysporum）。

图5 基于微管蛋白序列构建的相关菌株系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of related strains based on tubulin sequences

2.5 不同杀菌剂对芍药根腐病菌尖孢镰孢菌的毒力回归分析

由表2可知，供试的10种药剂对SY2020-2均具有较好的毒力效果，其中EC50小于10 mg·L-1的药剂有6种，由强到弱分别为30%丙硫菌唑、43%氟菌·肟菌脂、50%多菌灵、10%叶菌唑、20%氟唑菌酰胺和30%肟菌·戊唑醇，EC50分别为0.1、1.2、2.7、3.5、4.8和6.4 mg·L-1；43%戊唑醇和24%噻呋酰胺的EC50分别是13.6 和16.8 mg·L-1；25 g·L-1咯菌腈和3%苯醚甲环唑的EC50分别为124.4和600.2 mg·L-1。

表2 不同杀菌剂对芍药根腐病菌尖孢镰孢菌的毒力回归分析Table 2 Regression analysis of virulence of different fungicides against Fusarium oxysporum

3 讨论

芍药根腐病是危害芍药生长的主要病害之一，不但会造成大面积传播，而且危害程度较大。由尖孢镰孢菌为主要病原菌引起的芍药根腐病在芍药种植过程中普遍发生且危害严重。本研究通过实地调查发现，芍药根腐病在河西冷凉地区发生普遍，因此对其病原菌进行了分离与鉴定，并进一步在室内进行了药剂筛选和毒力测定。李丽[13]研究表明，导致芍药根腐病致病菌为茄腐皮镰孢菌（F. solani），且茄腐皮镰孢菌可与镰孢菌属内的其他镰孢菌混合侵染引起根腐病。李艳梅等[14]通过接种试验，证实茄腐皮镰孢菌和尖孢镰孢菌为大花蕙兰根腐病的主要病原菌，且混合接种后的发病率高于单独接种。本研究从河西冷凉地区的芍药根腐病病株中分离得到SY2020-2 菌株，通过其形态特征和分子生物学鉴定，将该菌株鉴定为尖孢镰孢菌；选用的10 种杀菌剂对尖孢镰孢菌都有一定的抑制作用，且随着用量的增大，抑制率逐渐增强。其中对尖孢镰孢菌毒力最强的药剂是丙硫菌唑（0.1 mg·L-1），氟唑菌酰胺（4.8 mg·L-1）、氟菌·肟菌脂（1.2 mg·L-1）、多菌灵（2.7 mg·L-1）、肟菌·戊唑醇（6.4 mg·L-1）、叶菌唑（3.5 mg·L-1）的毒力较强；而咯菌腈（124.4 mg·L-1）和苯醚甲环唑（600.2 mg·L-1）对尖孢镰孢菌的毒力相对较差。

目前，芍药根腐病的防治主要是在农业措施的基础上进行化学防治。本研究对河西冷凉地区芍药根腐病病原进行了鉴定，并对优势病原菌进行了室内药剂筛选，为芍药根腐病的田间防治提供了理论依据；筛选出了对尖孢镰孢菌毒力较强的药剂，今后，需对其田间防治效果进行进一步地验证。