养鸡发酵床垫料中脱硫菌的分离及鉴定

徐庆贤刘芸阮传清罗晓建

(1.福建省农业科学院农产品加工研究所，福建 福州 350003；2.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003)

伴随着养鸡集约化产生的大量粪便造成环境污染，已经成为制约养鸡业可持续发展的制约性因素。鸡粪由于其高蛋白质导致的强烈恶臭，在各种畜禽粪便中，比牛粪、猪粪危害更大，也更难处理[1]。鸡粪经微生物分解后，会产生硫化氢(H2S)、氨气(NH3)挥发性有机化合物(VOCs)等气体的排放，对人畜健康产生不利影响[2]，其中硫化氢是废气臭味的主要来源之一。在畜禽养殖过程中，提高粪污治理水平，可以大幅降低硫化氢、吲哚等恶臭气体的产生和病菌传播。微生物发酵床养殖技术是一种畜禽粪污治理模式，其将稻壳、锯末、秸杆等作物废弃物粉碎，做成垫料层铺设于养殖舍地面，再将动物养殖于垫料层上[3]。鸡粪便被垫料吸附、掩盖，并在微生物的作用下消解，可以减少粪便污染环境。

人工加入微生物可以调节菌群结构、缩短发酵周期、提高发酵床运行质量，降低有害气体的产生[4]，是发酵床运行良好的关键因素。采用发酵床法养鸡，在养殖过程中不需要对鸡粪进行人工清扫、贮存，也不用建沼气池、污水池和粪场，运行良好时可大幅降低氨气、硫化氢等恶臭气体，已在鸡的养殖中得到推广应用[5，6]。

此外，在我国南方地区，夏季温度高，鸡发酵床垫料不宜铺设太厚，这使得养殖过程中产生的硫化氢等恶臭气体的控制更加困难。因此，有必要筛选更多的脱硫菌，为制备理想的发酵床复合菌剂，抑制鸡舍硫化氢等恶臭气体的产生提供菌种资源。由于发酵床垫料不仅是微生物分解鸡粪的场所，同时也为这种分解提供碳源，本研究从养鸡发酵床采集垫料，通过富集、分离和脱硫效果测定，获得脱硫菌，为进一步研发发酵床复合菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 垫料样品

2022年11月14日在福建省顺昌县某发酵床养鸡场采集垫料样品。养鸡大棚面积1000m2，发酵床垫料厚度40cm，鸡品种为“优公”，26日龄。按5点采样法，在发酵床表面采集垫料，混合均匀，装入干净的自封袋，标记，用实验冰袋冷藏带回实验室，保存冰箱4℃冷藏备用。

1.1.2 主要培养基及试剂

1.1.2.1 脱硫菌富集培养基

蛋白胨10g、牛肉膏2g、氯化钠5g、硫化钠2g，调节pH值至6.5～7.5，加入蒸馏水至1L，分装至500mL三角瓶，121℃灭菌20min，备用。

1.1.2.2 脱硫菌分离平板

在脱硫菌富集培养基配方的基础上，按17g·L-1浓度加入琼脂，121℃灭菌20min，冷却至50℃倒平板备用。

1.1.2.3 主要试剂

Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；PCR扩增试剂(上海生工生物工程服务有限公司)；16S rDNA扩增引物(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，上海生物工程有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株富集、分离、纯化

取垫料样品10g，加入装有90mL灭菌水的三角瓶(灭菌前瓶中装入玻璃珠)，涡漩混合，再将三角瓶置于25℃，150r·min-1震荡30min，取出静置20min，移取上清液5mL至装有100mL富集培养基的三角瓶中，放置于37℃，150r·min-1摇床培养2d。从培养液吸取5mL，转移到新鲜富集培养基继续培养48h，如此连续转移培养5代。处理设3个重复。

吸取最后1次培养液1mL，用无菌水稀释10-4、10-5、10-6、10-7倍后，取0.1mL涂布于分离平板上，在30℃培养箱中培养48h。取出平板，观察菌落大小、形状、颜色，挑取不同特征的菌落，标记菌株号，采用三线法在新鲜的分离平板上纯化。将获得的纯化菌株分别采用斜面法和甘油法保存。

1.2.2 菌株的16s DNA序列分析

1.2.2.1 16s DNA序列的PCR扩增

取纯化菌株的培养物，采用Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR扩增的模板，利用16S rDNA引物进行PCR扩增。PCR反应体系(25μL)：ddH2O 18.7μL、10×Taq Reaction Buffer 2.5μL、10mmol·L-1/each dNTP 0.5μL、引物各1μL、Taq DNA Polymerase 0.3μL、Temple 1μL。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸10min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，用凝胶图像分析系统观察并保存。

1.2.2.2 PCR产物测序及序列对比分析

将扩增成功的PCR产物送交福州铂尚生物技术有限公司测序。将测序结果通过网站GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列比对分析，选择相关的参考菌株序列，再经Clustal X[7]对齐后，用软件Mega 5.0[8]进行聚类分析(方法为Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor)，构建聚类树[8-10]。

1.2.3 菌株脱硫效果比较

将获得的脱硫菌菌株在分离平板上纯化培养48h，将纯化好的菌株接种到脱硫菌富集培养基中，并以添加无菌水的培养基为对照，30℃、180r·min-1摇床培养48h。然后将培养的菌液取5%重新接入新的脱硫菌富集培养基中，对照组也取5%重新接入新培养基中，继续做空白对照，30℃、180r·min-1摇床培养。在培养的过程中依据《水质硫化物的测定 亚甲基蓝分光光度法》(HJ 1226-2021)，检测并记录0h、24h、48h、72h、96h的液体培养基的硫化物含量，并与空白对照组的硫化物含量进行对比，计算出硫化物降解率。

1.2.4 数据分析

在DPS数据处理系统中[11]，采用Tukey多重比较方差分析方法对不同处理的活菌数、pH和酸度进行比较。

2 结果与分析

2.1 菌株分离的结果分析

经16s DNA测序和GenBank(http：//www.ncbi. nlm.nih.gov)序列比对分析，并以软件NJ法(Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor)，结合Bootstrap method检验(检验次数为1000次)，构建系统发育树，如图1所示。从系统发育树可以看出，菌株Td51和Td-53处于同一最小分枝，紧邻的上一节点与Td52 Bootstrap值达91%，再上一节点与硬细胞芽孢杆菌Cytobacillus firmus strain NBRC 15306(NR_112635)相同，且Bootstrap method检验值为100%。菌株Td-54与枯草芽孢杆菌Bacillus stercoris strain D7XPN1(NR_181952)同处于最小分枝，且Bootstrap值达100%。菌株Td-55与硝化还原菌Nitratireductor aestuarii strain LMG 29090(NR 156984)最相似，Bootstrap值达99%。综合系统发育树分析结果，所获得的菌株主要是芽孢杆菌属(Bacillus)，如表1所示。

图1 分离菌株基于16S rDNA序列构建的分子系统发育树

表1 菌株样品序列比对结果

2.2 菌株脱硫活性测定结果

由表2可以看出，在菌株刚接入时各培养液的硫化物起始浓度为1.00mg·L-1，相互间无显著差异；24h后，接菌处理组的硫化物含量略低于对照组；48h后，接菌处理组的硫化物含量显著低于对照组。试验测得对照组硫化物残留24h后为0.93mg·L-1，96h后为0.92mg·L-1，基本没有变化。5株分离菌对硫化物96h后的降解率为34%～78%，因此，考虑菌株对硫化物去除率，菌株Td54、Td55去除率较好，可以作为下一步的研究对象。

表2 不同菌株培养液硫化物残留及降解率

3 结论与讨论

养鸡发酵床垫料中存在大量的微生物，虽然大部分微生物因为分解鸡粪产生恶臭气体，但也有部分微生物可以降解这些恶臭气体，因此可以将这类微生物作为筛选除臭微生物的潜在菌种。

本试验通过富集、分离纯化和16s DNA序列分析，从养鸡发酵床垫料分离获得5株具有脱硫功能的菌株，其中芽孢杆菌属(Bacillus)4株。目前已知的脱硫微生物有芽孢杆菌属、短杆菌属、硫杆菌属等10多个种属[12]。本文研究结果大部分属于芽孢杆菌属，与已报道脱硫微生物相似。刘雪纯等[12]从规模化猪场中分离筛选了2株能够高效降解硫的菌株，分别为地衣芽孢杆菌和粪产碱杆菌。李玥等[1]从鸡粪堆肥中分离到5株具有较好除臭效果的菌株均属于芽孢杆菌属，分别为Bacillus sp.、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、变异棒杆菌(Corynebacterium variabile)。李珊珊等[13]筛选出1株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。吴翔等[14]筛选1株原磷谷氨酸杆菌(Glutamicibacter protophormiae)。

通过水质硫化物的检测方法检测液体培养基中硫化物含量变化，结果表明，5株脱硫菌对硫化物的去除率在34%～78%。李珊珊等[13]报道的菌株对硫化氢的去除率为52%，吴翔等[14]报道的菌株对硫化氢的降解率为62.80%，本文分离的菌株中Nitratireductor aestuarii Td-55脱硫效果最强，去除率为78%。

在实际生产中，不同的微生物菌群可能起相互协同作用，选择不同菌株混合发酵极有可能进一步提高脱硫降解率。周东兴等[15]自蚯蚓粪中分离获得了芽孢杆菌、黄单胞菌和假单胞菌各1株，经组合后可使硫化氢降解率提高71.53%。因此，有必要下一步研究脱硫效果最强的Td-54和Td-55菌株，与其他互补拮抗脱硫微生物进行菌种复配，有望进一步提高菌株脱硫效果，提高在发酵床上的应用潜力。