贵港地区遗传性非综合征型耳聋孕期干预模式的研究

毛锦江，甘 冰，杨品莉，李 敏，杨燕嫣，韦舟玲

（贵港市人民医院产科，广西 贵港 537100）

耳聋（hearing loss）是一种最常见的人类感觉系统缺陷，70%的遗传性耳聋属于非综合征型听力缺损。遗传性耳聋按其遗传方式可分为常染色体显性、常染色体隐性、性连锁和线粒体遗传，按其临床表现可分为综合征型耳聋（syndromic hearing loss，SHL）和非综合征型耳聋（non-syndromic hearing loss，NSHL）[1]。我国人群最常见致聋基因——GJB2 基因（gap junctionproteinbeta-2 gene，GJB2 gene），突变检出率达21.6%，第2 位致聋基因——SLC26A4 基因（SLC26A4gene 或PDS gene）突变检出率为20.35%。线粒体DNA（mtDNA）突变是导致我国人药物性耳聋的主因，与个体携带线粒体12SrRNA 基因的A1555G 和C1494T 敏感突变相关检出率之和达1.87%[2]。通常听力正常夫妻如果双方均属于隐性遗传基因引发的病变异常携带者，此时胎儿约有25%的可能为获得父母双等位基因致病变，而成为遗传性耳聋患者[3]。本研究拟在听力正常的孕妇且无耳聋家族史及其分娩的新生儿均中开展耳聋基因携带率与突变谱的调查，提供遗传咨询与生育指导的干预模式，现将研究报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2019 年9 月-2021 年12 月来贵港市人民医院检查听力正常，且无耳聋家族史的孕妇及其分娩的新生儿为研究对象。研究开始之前签署知情同意书，自愿接受耳聋基因检测。本研究通过医院伦理审批。采用随机分组法分组，研究组为1806 例孕妇及其分娩的新生儿，携带者丈夫进行耳聋基因测序。对照组为同期1810 例孕妇未行耳聋基因检测，仅对其分娩新生儿出生后进行耳聋基因检测。

1.2 方法

1.2.1 DNA 的提取 用含EDTA-K3 的真空采血管，新生儿系采集脐带血2.0～3.0 ml，或采用足跟采血，制作血斑卡；孕妇采集静脉血2.0～3.0 ml。采用血液基因组DNA 提取试剂盒（KZ-4801），提取纯化DNA。用紫外分光光度法检测DNA 质量浓度和纯度，确保DNA 质量浓度≥200 ng/L，纯度为A260/A280 的比值在1.8～2.0，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR 扩增 配置PCR Mix 的扩增反应液，每个标本分A、B 两种反应液，各加入提取好的样本DNA 3 μl，按以下程序进行PCR 的扩增，先预变性：95℃，9 min；再95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，共40 循环；最后72 ℃5 min，16 ℃10 s 完成扩增。

1.2.3 耳聋基因杂交检测 PCR 扩增反应条件：PCR产物热变性成为单链DNA，在医用核酸分子杂交仪2012A 与低密度基因芯片探针杂交，通过显色反应，得到清晰可见的检查结果。按照耳聋基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法）的操作说明书，测定4 个我国常见的耳聋易感基因的13 个热点突变位点，包括GJB2（35delG、176del16、235delC、299delAT、155delTCTG）、SLC26A4（IVS7 -2A ＞G、2168A ＞G、1229C ＞T）、线粒体DNA（1494C ＞T、1555A ＞G、7445A＞G、12201T＞C）、GJB3（538C＞T）点。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件对数据进行分析。运用频数（%）描述2019-2021 年贵港部分孕妇及其新生儿、携带者丈夫的耳聋基因相关病例等资料。两组数据比较主要采用χ2检验进行分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1806 例孕妇耳聋基因检测结果 1806 例孕妇中有74 例携带，携带率为4.09%，其中GJB2 基因携带者37 例，携带率为2.05%。SLC26A4 基因携带者32例，携带率为1.77%。药物性耳聋基因携带者5 例，携带率为0.28%。GJB3 基因携带者0 例，见表1。

表1 1086 例正常听力孕龄女性人群耳聋基因携带率与突变谱调查（n，%）

2.2 携带者夫妇耳聋基因检查结果 对74 例突变携带者进行电话随访，通过宣教及知情告知，38 例孕妇的配偶接受了耳聋基因芯片及相应基因的测序检测，36 例耳聋基因测序均为阴性，2 例为阳性，耳聋基因型为，均与孕妇不同型。随访新生儿3 例发生与孕妇相同基因突变的携带者，35 例新生儿耳聋基因检测未见异常，见表2。

表2 携带者夫妻耳聋基因突变位点情况

对这38 对致聋突变携带者进行遗传指导，告知先天性聋儿发生的几率和风险。28 例GJB2 基因突变致聋属于常染色隐性遗传，其中26 例由于其丈夫耳聋基因测序均为阴性，其胎儿不会发生先天性耳聋，继续妊娠，其中1 对夫妇分娩新生儿确诊为杂合突变携带者，听力筛查正常。2 例孕妇其丈夫耳聋基因测序为阳性，但是与孕妇不同型，其胎儿不会发生耳聋基因纯合子，不会导致耳聋儿因此没有进一步做羊水穿刺产前诊断，继续妊娠，2 例分娩新生儿确诊为杂合突变携带者，与孕妇一致，听力筛查正常。9例耳聋基因检测结果为SLC26A4 基因杂合突变，其丈夫耳聋基因测序阴性，分娩的新生儿耳聋基因均正常。因SLC26A4 基因杂合突变为大前庭导水管综合征患者，向孕妇发放大前庭导水管综合征患者注意事项卡片，指导其在日常生活中避免因剧烈运动或者头部受到撞击等环境因素引发运动性耳聋，尽量延缓患者耳聋发生的时间。3 例耳聋基因检测结果为线粒体1555M 均质突变，其丈夫耳聋基因测序阴性，分娩的新生儿耳聋基因均正常。线粒体基因杂合突变，为药物性耳聋，遵循母系遗传模式。

2.3 最终分娩的新生儿耳聋基因检测情况 研究组1806 例孕妇中，有86 例新生儿未行耳聋基因检测，包括孕妇在外院分娩47 例、病理妊娠35 例以及失联4 例，研究组新生儿携带率高于对照组，但差异无统计学意义（χ2=0.062，P=0.804），见表3。

表3 两组新生儿携带耳聋基因比例（n，%）

2.4 随访结果 对74 例携带者孕妇进行了电话随访60 例新生儿耳聋基因携带，均通过听力筛查。10 例在外院分娩，未行耳聋基因检测，均通过听力筛查。4 例未能追踪。

3 讨论

耳聋是最常见的出生缺陷之一，新生儿期的发病率为1‰～3‰，学龄期儿童耳聋的发病率增加至3‰～4‰[4-6]。只针对聋人的筛查和干预不能很好地阻断遗传性耳聋在人群中的传递和发病，扩大耳聋基因诊断应用范围就很有必要。如果在听力正常的孕妇中进行致聋基因携带率与突变谱的研究，可为耳聋基因筛查、遗传咨询、疾病管理提供一定的数据资料。按表型特点不同分为综合征性耳聋（SHL）和非综合征性耳聋（NSHL）。根据遗传方式不同将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传（AD）、常染色体隐性遗传（AR）、X 连锁遗传、Y 连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以AR 耳聋最多见，占75%～80%。

本研究通过对1806 例贵港地区听力正常且无耳聋家族史的孕妇，进行常见GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体12SrRNA4 个耳聋相关基因的9 个致聋突变位点进行检测，明确其耳聋基因突变携带情况。对携带耳聋基因突变的孕妇，同时对其配偶进行基因诊断，在夫妇双方基因诊断明确的基础上，利用产前基因诊断技术来阻断遗传性耳聋的传递。本研究发现74 例携带，耳聋病易感基因突变携带率为4.09%，其中GJB2 基因携带者37 例，携带率为2.05%；SLC26A4 基因携带者32 例，携带率为1.77%；药物性耳聋基因携带者5 例，携带率为0.28%；GJB3 基因携带者0 例。GJB2 基因与SLC26A4 基因突变携带率占比较大，合计约93.24%，与国内学者的研究相似[7-9]。常见GJB2 基因突变类型主要有235 del C、299 del AT，与刘畅等[10]的研究相似。

本研究中，GJB2 基因在贵港地区非综合征性耳聋（NSHL）患者中的突变频次为37 例检出率为20.48%，235M 突变杂合子，占该基因突变位点的94.59%，位点在本地区NSHI 者中为GJB2 基因主要致病位点。与林文津等[11]报道的检出率11.06%有差异，与刘双双等[12]报道的19.1%相近，表明存在明显的地域性差。本研究中SLC26A4 基因突变率为1.77%，仅次于GJB2 基因，其中SLC26A4 IVS7-2A＞G 突变占SLC26A4 基因总突变的78.12%，与之前的研究相似[13]。其中38 例携带者的丈夫进行芯片检测和相应基因测序36 例均为阴性；2 例为阳性携带者，但是与孕妇耳聋基因不同型。因病例少，尚未发现有同一突变携带者的夫妻，因此未有需进行产前诊断的病例。其最终分娩的新生儿有3 例为耳聋基因携带者，均通过听力筛查。

既往研究发现[14，15]，引发耳聋的致病因素主要有两种，即一是遗传因素、二是环境因素，约60%的耳聋患者为遗传性耳聋。根据经典的孟德尔遗传规律，新生儿携带的耳聋基因是由父母的遗传所致[16]。遗传咨询的目的是通过家系遗传分析和生育指导以减少先天性耳聋发生率和患儿出生率。本研究根据不同基因突变的特点进行遗传咨询，对于检出的突变携带者则进行成年后的配偶选择和优生优育指导。对于夫妻双方均为相同基因突变携带者，每妊娠一次均有1/4 几率为纯合子，可进行胚胎植入前诊断（PGD），在孕前阻断耳聋出生缺陷，将预防关口前移，真正做到耳聋的一级预防[17]。如对于携带不同基因突变的夫妻，因其子代没有成为纯合子的可能，一般不建议PD 或PGD。GJB2 与SLC26A4 相关耳聋主要表现为常染色体隐性遗传非综合征性耳聋，线粒体12SrRNA 突变与SLC26A4 基因突变均为迟发性耳聋。SLC26A4 基因位于7q31，Pendrin 属于编码穿膜蛋白，其是常染色体隐性遗传，以上基因的突变会引发先天性耳聋，或是迟发性耳聋，而且还会伴有前庭水管扩大，此时建议患者积极预防头部外伤和感冒等[18]。

线粒体12SrRNA 突变可认为是药物性耳聋突变mtDNA A1555G 和C1494T 突变携带者表现为对氨基糖甙类药物敏感，是导致氨基糖甙类抗生素致聋和非综合征性耳聋的重要原因之一。线粒体DNA 12S rRNA 基因突变是氨基糖甙类药物诱导性耳聋的重要遗传机制[19]，遵循母系遗传模式。本研究发现5 例孕妇为线粒体12S rRNA 1555A＞G 均质突变，突变率为0.46%，与国内其他报道的结果较低[20]。针对携带线粒体基因突变的孕妇进行了药物性耳聋遗传咨询，为突变携带者及其母系亲属提供了详细的用药指导，禁服氨基糖甙类抗生素，以避免药物性耳聋的发生。夏家辉院士发现的首个我国本土耳聋相关基因是GJB3 基因，其主要表型为语后进行性高频听力感音神经性耳聋。其致病机制有待于研究。本研究研究组孕妇中没有发现GJB3 基因携带者，对照组新生儿发现1 例GJB3 基因携带者。

出生缺陷预三级预防措施包括：一级预防，指防止出生缺陷儿的发生，而耳聋的一级预防指耳聋基因普遍性筛查；二级预防，指减少出生缺陷儿的出生，而耳聋的二级预防通过对聋人群体婚配生育指导以及遗传性耳聋家庭的产前诊断，减少耳聋的出生，也是目前耳聋预防与干预主要手段；三级预防，指出生缺陷儿及早发现和治疗，而耳聋的三级预防是指新生儿听力筛查。单纯行听力筛查存在自身局限，不能及时发现和预测出生时未表现出听力下降的新生儿耳聋携带者，导致遗漏迟发性聋、药物性耳聋。针对一级预防，孕妇进行耳聋基因检测，如夫妇均携带同一耳聋基因突变，给予遗传咨询及生育指导，包括胚胎植入前诊断、接受捐赠配子、产前基因诊断等。还可以告知胎儿将来婚配对象进行相应耳聋基因的检测，避免其后代出现耳聋患儿。如果为线粒体遗传耳聋基因突变携带者，遗传咨询中需充分告知其母系遗传方式及其与药物诱导性耳聋的关系，并给予用药指导。

本研究中有35 例新生儿为携带者，对照组有39 例新生儿为携带者，两组新生儿听力筛查均正常。研究认为对孕妇及新生儿性耳聋基因筛查可作为发现一种新生耳聋的筛查工具，对孕妇及新生儿携带迟发性耳聋基因进行分析病因，给予预防指导，可降低迟发性耳聋发生，筛查结果阴性可解读为在本筛查范围内未发现相关致聋基因的变异[21]。

综上所述，通过听力正常的孕妇及其新生儿行耳聋基因检测，携带者配偶行耳聋基因测序，必要时行羊水穿刺产前诊断，可避免双方均为同一耳聋突变基因携带者的夫妇生育聋儿，及早地发现药物性耳聋敏感个体、迟发性遗传性耳聋个体。建立适合贵港地区遗传性耳聋一级预防模式，通过遗传咨询和生育指导、早期干预和康复，降低贵港地区遗传性耳聋的发生率和患儿出生率可有效预防耳聋发生。