PI3K/Akt 在膝骨关节炎中调控软骨细胞凋亡的作用机制

陈永洪，顾兴科

（宜宾市中西医结合医院骨伤科，四川 宜宾 644100）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）在退行性关节疾病中占比较大，可损害全身各类关节（如手、膝和髋关节）。迄今为止，针对OA 的医疗难题对于专科医师而言仍是巨大挑战，其定义、潜在致病因素和病理生理学研究仍处在进展中[1]。疼痛、短时间晨僵和骨擦音是其主要症状，晚期可致关节失稳和肢体残疾，极大影响患者日常生活。OA 可分为原发性（或特发性）和继发性（根据公认的病因，如创伤、关节结构手术和出生时关节异常等）。原发性OA 常由联合风险因素致病，高龄和肥胖是最突出的致病因素[2]，其它危险因素包括膝关节错位、关节生物力学负荷增加、遗传以及最近提出的低度全身炎症[3]。近期研究发现在众多危险因素作用下，膝关节骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）在高龄国民群体中的患病率以及发病率均为最高[4]。随着KOA 相关研究的深入，众多学者认为KOA不属于一种膝关节局部病变，而是一种膝关节内软骨、膝关节囊、膝关节软骨下骨、膝关节内韧带、和膝关节内滑膜的整体病变[5]。然而，在KOA 的发生发展众多环节中，关节内软骨的损伤及凋亡属于不可逆性病变，有关软骨细胞凋亡的病因病理机制至今仍存在争议[6]。长期以来，虽然众多学者对KOA 的研究都聚焦在关节软骨的变化上[7，8]，但是对调控软骨细胞凋亡的相关因子缺乏重视。近年来，有研究发现[9]，肿瘤细胞众多增殖、凋亡过程可以被磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylin ositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，别名Akt）信号传导通路调控，而软骨细胞的凋亡程序亦可被其调控。这一过程主要由PI3K/Akt 通路下游的关键分子主导，如凋亡加速蛋白Bad、细胞核转录因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinas，Caspase）等出现转录、表达情况的不同，从而调节细胞凋亡的活动。本文对PI3K/Akt 信号通路在分子水平上调控软骨细胞凋亡的作用机制进行了总结，以期为临床医师的相关诊断和治疗工作提供参考。

1 PI3K/Akt 信号通路概述

PI3K/Akt 信号通路是各种信号通路中熟为人知的一条经典信号通路，其在各类组织、细胞中主要调控细胞的基本活动及细胞周期等，作用重大[10]。脂质酶PI3K 包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3 类激酶，其中研究与应用最广泛的是Ⅰ类。因激活Ⅰ类激酶受体的不同，Ⅰ类激酶又有ⅠA 与ⅠB 两个不同的亚类之分。从结构上看，ⅠA 类激酶包含了两个重要的部分，一是调控亚基p85，另一部分则是催化亚基p110[11，12]，由酪氨酸激酶激活；ⅠB 类激酶同样包括两个部分，一是催化亚基p110γ，另一部分则是调节亚基p101，G蛋白可直接激活或由G 蛋白偶联受体激活[13，14]。当细胞膜受体被膜外生长因子、激素、细胞因子等适宜因子刺激时，此时PI3K 的p85 调控亚基的SH2 结构域发生磷酸化，募集Akt 使其朝着细胞膜聚集；此时位于细胞膜上的4,5-二磷酸脂酰肌醇（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）被催化亚基p110 磷酸化，由此PIP2 磷酸化成为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）[15]。胞内Akt 最终被PIP3 激活，启动下游反应。

PKB 是整个PI3K/Akt 转导路径中重要的一环，其来源于逆转录病毒Akt8，由病毒的v-Akt 基因转录后产生，因此，也称Akt。Akt 也被分为Akt1/2/3（PKBα/β/γ）三种不同的亚型，各亚型虽有不同，但各个亚型间具有极高相似性，它们都具有三个不同作用的蛋白结构域，分别是PH、催化与调节结构域，第一个PH 结构域负责蛋白、脂质两种不同物质间的作用过程；第二个催化结构域包含了苏氨酸，对Akt 的活化过程有一定辅助作用；第三个则是包含了丝/苏氨酸的调节结构域，是Akt 彻底被激活后传递信号的必须功能区。PI3K/Akt 信号通路首先在Akt 被激活后便可启动，随后发生串联反应，活化的Akt 具有使Bad、Caspase-9 等凋亡前蛋白、凋亡相关死亡基因磷酸化的功能，抑制细胞凋亡，进而达到经多种传导通路抑制细胞凋亡的目的[16]。

2 PI3K/Akt 信号通路对软骨细胞凋亡的调节途径

在现有研究中，与KOA 发生发展相关的经典信号通路众多，如内质网应激反应通路、线粒体通路、死亡受体通路等[17-20]。随着对KOA 相关信号通路临床研究的深入，临床医师们发现了几条可调控软骨细胞凋亡的关键信号通路被，例如PI3K/Akt[21]、p38 MAPK[22]、Piezo1[23]、HIF-1[24]、Wnt/β[25]、NF-κB[26]。医师们通过对信号通路中关键调节因子的调控，控制效应分子的表达水平，延缓、减少了软骨细胞的凋亡，最终达到预防、治疗KOA 的目的。在众多与软骨细胞凋亡相关信号通路中PI3K/Akt 起到至关重要的作用近年来关于该信号通路在膝骨关节炎中的研究相对较少，其在膝骨关节软骨细胞中的作用机制主要包括以下途径。

2.1 Bad 途径 促凋亡蛋白Bad 是一种促凋亡因子的伴侣分子，通过调节B 细胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/抗凋亡蛋白Bcl-xL的比例来发挥其促凋亡的作用。在细胞凋亡调控中，Bad 其作用与Bcl-2 不同，Bcl-2 具有明显抑制细胞凋亡的作用，Bcl-2 二聚体大量合成诱导软骨细胞存活。在KOA 患者中，高浓度Bad 使Bcl-xL/BAX、Bcl-2/BAX 中的BAX 游离出来，BAX 二聚体因此而占主导，使得软骨细胞凋亡加速[27]。与之不同的是，活化的Akt 可以磷酸化Bad 的残基位点丝氨酸136/112，Bad 与Bcl-2、Bcl-xL 分离，此时因抗凋亡蛋白的存在，分离出的Bad 不会促进细胞凋亡，因与其相结合而抑制凋亡。同时分离出的还有Bcl-2，其本身具有抑制细胞凋亡的功能，因此延缓KOA 的发生发展[28]。此外，122Bad 分子是Akt 下游的一个重要效应因子，对caspase-9 和caspase-3 一类可以加速凋亡的相关因子有至关重要的激活作用[9]，PI3K/Akt 信号通路正是对Bad 表达控制，可以间接地对上述凋亡相关因子的活性起抑制作用，最终完成对软骨凋亡的抑制。王春玲等[27]通过小鼠H22 细胞株的凋亡活动对PI3K/Akt 信号通路下游的Bad蛋白表达水平呈现出剂量依赖性，验证了细胞凋亡活动对PI3K/Akt 通路的Bad 蛋白的依赖性。高玲等[29]在研究益髓解毒方时发现上调大鼠Akt 及Akt mRNA 表达，使Bad mRNA 及Bad 蛋白表达得到抑制后大鼠的细胞损害、凋亡明显减少，表明了此通路与抗细胞凋亡功能的相关性。由此可知，可利用PI3K/Akt 通路的Bad 途径，抑制Bad 蛋白的表达，可有效抑制软骨细胞凋亡。

2.2 mTOR 途径 在众多哺乳动物体内可以发现雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），其调控着细胞的新陈代谢、增殖活动及细胞周期等多个方面，其中mTOR 主要参与细胞的自噬活动。在真核细胞中，为了应对损害性的刺激，自噬活动主要是针对已产生功能障碍的胞内细胞器进行降解并回收其中可以循环利用的原材料，以供给新的胞内物质合成活动[30]。mTOR 在细胞自噬活动中以mTORC1 复合物和mTORC2 复合物两种形式起作用，研究表明前者主要负责负向调节细胞的自噬活动。当软骨细胞处于炎性不利环境，上游磷酸化的Akt 会负向调节结节性硬化复合物1/2 的生物学功能，使得mTORC1 复合物活化，最终使得人自噬启动蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）的起始功能抑制点位磷酸化，软骨细胞的自噬活动因此获得负向调节[31]。除此以外，mTOR 控制着PI3K/Akt/mTOR 通路下游分子LC3、ATG、Beclin-1 等效应分子的活化，软骨细胞内自噬得到负向调节[32，33]。

KOA 的发生与机体的自噬调节关系甚密，当KOA 发生时，PI3K/Akt 的mTOR 途径启动，而自噬抑制基因可被mTOR 信号调控，软骨细胞的自噬活动可出现明显抑制，软骨细胞自噬活动对软骨细胞的保护作用明显降低，此时KOA 患者关节内软骨细胞凋亡明显增加，加速了KOA 的发生发展[34，35]。Zhang Y 等[36]在OA 患者及体外试验中发现mTOR过表达，而且在关节内软骨细胞观察到mTOR 表达上调与凋亡加速、自噬抑制密不可分。随后，其研究证明，软骨细胞自噬活动会被细胞内特异性的mTOR 消解而增强，并显著保护了由内侧半月板不稳定诱导的KOA，同时软骨的降解、细胞的凋亡和滑膜的纤维化都得到明显抑制。此外，其实验还表明mTOR 对ULK1/一磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路的调节可能在一定程度上负责调节关节软骨中的自噬信号以及分解代谢和合成代谢因子之间的平衡。Shi X 等[37]发现沉默泛素样含植物同源结构域和环指结构域1 蛋白（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）可以减弱哺乳动物软骨细胞中IL-1β 对PI3K/Akt/mTOR 信号通路靶点的上调，然后，通过对UHRF1 的敲除增强细胞自噬性，可保护OA 软骨细胞免受凋亡影响。哺乳动物体内经mTOR 途径的自噬活动，不论是炎性环境的被动负向调节，还是人为主动的基因敲除正向调节，都证明了可经PI3K/Akt 通路中的mTOR 途径调节软骨细胞凋亡活动，从而影响KOA 的发生发展。

2.3 NF-κB 途径 NF-κB 在肿瘤细胞存活过程中的典型作用是抑制细胞凋亡，使肿瘤细胞在增殖和凋亡动态变化过程中获得生存优势。而NF-κB 需要IKB 激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）激活，使得NF-κB 转位入核，激活抗凋亡相关基因转录，促进细胞存活。同时，NF-κB 转录开始后，可以促进下游Bcl-2 蛋白家族成员的高表达，当Bcl-2/Bcl-xL 占主导时，相关细胞会促进存活而抑制凋亡。Yu M 等[38]发现黄岑素可辅助化疗药物抑制肿瘤进展的作用机制是通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路，从而抑制了上皮-间质化过程并减少了抗凋亡基因的转录。杨鑫等[39]也证明在大鼠关节炎诱导模型中，PI3K/Akt 及下游的IKKαβ、IKBα 的磷酸化均得到抑制，加强了关节炎模型的软骨细胞凋亡。在KOA 发展过程中，其中细胞外基质可因为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的互相作用而快速降解，同时抑制NF-κB 的转录、加速关节内软骨的损伤、凋亡[40]。但Lin C 等[41]从另一方面在成骨前细胞内发现激活PI3K/AKT 下游的NFκB 可以增强细胞的增殖、分化和MMP-13 的表达，诱导了OA 小鼠模型的异常骨形成，加速了软骨的退变。尽管目前经PI3K/Akt 通路下游的NF-κB 途径调节软骨细胞增殖、凋亡仍存在争议，但NF-κB途径在抑制软骨细胞凋亡中的作用不可忽视，该途径在软骨细胞增殖、凋亡中的完整机制有待进一步深入研究。

2.4 Caspase 途径 Caspase 本质是促凋亡因子，而其中经线粒体途径促进细胞凋亡活动的最重要的启动者是Caspase-9。细胞色素C 和凋亡酶激活因子Apaf-1 两者是启动促凋亡活动的关键因子，两者结合Caspase-9 后，Caspase-9 立即从无生物学活性的前体酶形式被活化，形成新的具有促凋亡活性的Caspase-3 和Caspase-7。在KOA 发生发展中，Caspase 可以发生级联反应，首先是Caspase-9 被活化，而后其效应者Caspase-3 将被进一步活化，两者共同促进软骨细胞的凋亡活动[42]。而在PI3K/Akt 通路中，Akt 一旦被活化，Caspase 促凋亡因子的Ser196基团会因其而失活，达到抑制软骨细胞凋亡的目的[9]。朱思行等[43]在大鼠模型上的研究再次证明，激活PI3K/Akt 通路后，活化的Akt 会直接抑制Caspase-9 的表达，然后Caspase 串联反应随之被负向调节，促凋亡的Caspase-3 难以被激活，细胞凋亡明显减少。有研究[44]证明了软骨细胞中肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）的缺乏下调了Bcl-2，而增加促凋亡因子caspase-3 增强软骨细胞的凋亡。同时，关节软骨内IRE1α 的激活增加了细胞的生存率并减少了凋亡。由此可知，激活PI3K/Akt 通路可以有效抑制Caspase 的活化，经Caspase途径直接抑制软骨细胞的凋亡活动，减缓KOA 的发生发展。

2.5 GSK3β 途径 糖原合成激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）属于一类相对保守的蛋白激酶，许多细胞功能的调控与之有关，其生物学活性主要由Akt 负向调节。在各类细胞培养中发现，GSK3β 的过表达会引发细胞凋亡程序。KOA 患者膝关节软骨细胞会高表达Akt、GSK3β mRNA，低表达GS mRNA，诱发软骨细胞凋亡活动。有研究在KOA模型兔中发现[45]，物理治疗干预后，其Akt-GSK3β信号通路中关键分子Akt、GSK3β 和GS mRNA 明显低表达，证明Akt-GSK3β 信号通路被抑制后，可缓解软骨基质的退变。Huang PY 等[46]最近对OA 样本的miRNA 和mRNA 表达谱进行生物信息学分析，GSK3β 是筛选出的6 个关键基因之一，并利用qRT-PCR 验证表达水平，发现GSK3β 的表达与OA的发生呈负相关。An X 等[47]利用小针刀联合脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cells，ASCs）对KOA兔模型进行干预后发现，关节软骨内GSK3β mRNA 及蛋白表达显著降低，细胞变性减少、细胞凋亡活动受抑制。结合临床OA 患者样本回顾与动物实验，证明了软骨细胞的凋亡活动可以经PI3K/Akt通路中的GSK3β 途径进行调节，抑制GSK3β 的转录、表达可有效抑制软骨细胞凋亡活动。

3 总结

PI3K/Akt 信号通路紧密的与细胞凋亡活动具有密切联系，其中的调控机制多种多样，与之相关的细胞因子不胜枚举。而软骨细胞凋亡活动与KOA进程密切相关，如何利用好这条信号通路抑制软骨细胞凋亡，将会为预防、治疗KOA 提供一些新思路。PI3K/Akt 信号通路中有诸多特殊的细胞因子或蛋白标志物，今后的基础研究和临床试验以此基础，寻找有效靶点调控信号通路表达，针对性进行药物、物理治疗，多途径对KOA 进行预防和治疗。