复合酶-超声波辅助提取火龙果花黄酮及抗氧化性研究

张中华，徐西俊，陈凤真*，阮 帝，李 霞，何 盈

（1.菏泽市农业技术推广中心，山东菏泽 274000；2.菏泽学院农业与生物工程学院，山东菏泽 274000）

火龙果（Hylocereus undatusBritt）是仙人掌科植物[1]。火龙果每朵花质量达600～800 g，因此被称为“大花王”[2]。火龙果花富含营养元素和生物活性成分，具有抑菌、消炎、清火、润肺、止咳、增强免疫力、降血糖、治疗高尿酸症等作用[3-4]；其所含的黄酮具有抗氧化[5]、抗炎[6-7]、降血脂及预防动脉粥样硬化等生物活性[8-9]。目前，火龙果花在我国的主要利用方式是食用，食用人群主要集中在南方地区，北方地区很少有人食用。近年我国北方逐渐扩增火龙果种植面积，产生大量的火龙果花，被疏掉的花朵极少一部分被食用，大部分被作为农业副产物丢弃，造成资源浪费。目前关于火龙果花黄酮的研究不多。李国胜等[10-11]以乙醇为溶剂，采用正交试验建立了火龙果花的提取工艺条件，测定黄酮含量为2.787 mg/g，研究结果表明火龙果花具有较强的抗氧化性。罗小艳等[12]建立了黄酮的最佳提取条件，提取的火龙果花中黄酮含量为0.747%。单一乙醇提取法提取率较低，超声波辅助提取具有提取效率高、能耗低、保护环境等优点[13]。酶辅助超声波提取结合超声波法和酶法的优点可以缩短提取时间、提高提取效率，条件温和，节约能源。

本文以火龙果花为研究对象，采用复合酶-超声辅助提取，对影响黄酮提取率的因素进行了单因素试验分析，然后利用Plackett-Burman 设计对单因素进行显著分析，对影响显著的因素采用响应面法优化火龙果花黄酮提取工艺。最后通过对ABTS+·、超氧阴离子清除能力评价黄酮的体外抗氧化活性，以期为火龙果花的综合利用提供理论依据，提高火龙果花附加值，促进火龙果花黄酮在功能性食品和医药中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

将市场购买的干燥红皮白肉品种火龙果花粉碎，过80 目筛，在通风处用石油醚进行脱脂处理12 h，回收石油醚，抽滤，烘干。

1.2 试剂

2,2- 联氮- 二(3- 乙基- 苯并噻唑-6- 磺酸)二铵盐2,2’-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)ammonium salt，ABTS，纯度98%、纤维素酶（50 U/mg）、果胶酶（50 U/mg），上海阿拉丁生化科技股份有限公司，芦丁标准品（京坛墨-标准物质质检中心），其它所用化学试剂均为分析纯。

1.3 火龙果花黄酮的提取与含量测定

精确称量经预处理的火龙果花粉末，加入乙醇提取液与酶液，超声辅助提取，5 500 r/min 离心8 min 后，取上清液1 mL，然后加入样品溶液用于测试。所有实验处理均为重复3 次。采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定火龙果花中的黄酮含量[14]。配制浓度梯度为80～200 μg/mL 的芦丁溶液，在510 nm 处测定吸光度并绘制标准曲线。得回归方程为Y=0.007X-0.002 3，R2=0.998 7，回归方程可用。黄酮提取率计算公式见式（1）。

式中，c为提取液黄酮质量浓度，mg/mL；V2为测定时反应体系的体积，mL；V1为提取液的体积，mL；V3为测定时吸取的体积，mL；m为称取的样品的质量，mg。

1.4 单因素试验

固定纤维素酶∶果胶酶酶比为2∶1，加酶量2 000 U/g，pH 值5，超声温度30 ℃，超声时间40 min，依次以乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL/g）、酶解时间（30、60、90、120、150 min）、酶解温度（45、50、55、60、65℃）与超声功率（150、180、210、240、270 W）为变量进行单因素实验，以确定的上一个因素最佳工艺条件固定不变，其它条件不变。

1.5 筛选试验与响应面试验设计

以单因素试验结果为依据，从液料比、乙醇体积分数、酶解时间、酶解温度、超声功率共5 个因素中筛选出对提取率影响显著的因素。以黄酮提取得率为评价指标，然后对影响显著的因素进行响应面优化试验。

1.6 抗氧化性测定

ABTS＋·的测定：参考王思溥等[15]和Zhou 等[16]方法。

超氧阴离子的测定：参照郭雪峰等[17]和Marklund等[18]的方法。

1.7 数据处理

单因素试验数据处理与作图使用Excel 2010 软件；单因素显著性采用SPSS 21 统计软件进行分析；方差分析与响应面绘图分别采用Design-Expert 12 和Origin 2018 软件分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

由图1 中可以得到，随着乙醇体积分数的增加，黄酮得率先上升后下降再上升，当达到70%时，得率达到最大为9.41%；较低或较高的乙醇体积分数，其极性均不利于黄酮的溶出，此外高浓度的乙醇还会加大其他醇溶性物质的溶出，对火龙果花黄酮产生竞争性抑制溶出从而影响黄酮类化合物的提取率[14]。因此，确定最佳乙醇体积分数为70%。

图1 乙醇体积分数对火龙果花黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

2.1.2 液料比对黄酮提取得率的影响

从图2 中可知，随着液料比的增大，黄酮提取得率增加；由于提取体积小，酶与底物未能充分接触，使一部分样品未能完全浸出，因此提取率较低[14]，适当的液料比提高了火龙果花黄酮的提取得率。当液料比为50∶1（mL/g）与40∶1（mL/g）时，黄酮提取得率差异不显著；考虑到降低提取成本和对环境的污染，因此选择最佳提取液料比为40∶1（mL/g）。

图2 液料比对火龙果花黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

2.1.3 酶解时间对黄酮提取得率的影响

由图3 可知，黄酮提取得率随酶解时间延长先升高后下降，酶解90 min 时，黄酮提取得率最高，为8.04%；这可能由于酶解底物溶出需要一定时间，时间短，黄酮溶出不彻底，提取率较低；当酶解超过90 min 后，杂质溶出也增多，杂质可能与黄酮发生反应，导致提取率下降。因此最佳酶解时间为90 min。

2.1.4 酶解温度对黄酮提取得率的影响

如图4（见下页）所示，火龙果花黄酮提取得率随着酶解温度的升高先上升后下降。50 ℃的提取得率显著高于其它处理，这可能是由于酶解温度为50 ℃时，复合酶的活性最高，使黄酮高效地游离在溶液中；酶解温度进一步上升会使酶活性降低或部分失活，导致黄酮提取率下降。因此确定最佳酶解温度为50 ℃。

图4 酶解温度对火龙果花黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of flavonoids from pitaya flower

2.1.5 超声功率对黄酮提取得率的影响

图5 显示，随着超声波功率的增大，火龙果花黄酮的提取得率先升高后下降。超声波功率较低时，超声波空化产生的压力小，细胞破碎不完全，黄酮提取得率较低；随着超声波功率的增大，由细胞液中的空化作用而产生更多的空化泡，使破碎作用增强，黄酮提取得率增加[14]。当超声功率超过240 W 时，可能用于功率太大，破坏了黄酮结构，导致提取得率下降。因此，超声波输出功率在240 W 时提取效果最佳。

图5 超声功率对火龙果花黄酮提取得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of total flavonoids from pitaya flower

2.2 Plackett-Burman 筛选试验结果

由表2、3 可知，模型P＜0.01，说明模型极显著，模型可以反映黄酮得率随各因素的变化情况；模型的相关系数R2为0.951 7，说明方程的拟合度极好，能真实地反映四个变量与黄酮提取得率的关系；R2Adj（调整确定系数）为0.911 5，说明该方程能解释91.15%响应值的变化，R2pre为0.807 0，反映了预测值与实际值有较高的相关性。乙醇体积分数和酶解时间对火龙果花黄酮提取率达到极显著影响，液料比达到显著影响，其它因素影响不显著。因此选择乙醇体积分数、酶解时间与液料比这三个显著或极显著因素作为响应面优化设计的变量，设定酶解温度为50℃、超声功率为240W。

表2 Plackett-Burman 试验设计Table 2 Test design of Plackett-Burman

表3 Plackett-Burman 试验设计的方差分析Table 3 Analysis of variance of Plackett-Burman test design

2.3 响应面法优化火龙果花黄酮的提取工艺

2.3.1 响应面试验结果

以液料比、乙醇体积分数和酶解时间作为响应变量，以黄酮提取率作为响应值，采用Design-Expert 12 软件进行分析，建立二次回归多元方程为Y=-6.882 5+0.74492A-0.16222B+0.13903C+0.00045AB-0.002775AC+0.001 191 67BC-0.006 31A2+ 0.000 64B2-0.000 80C2。响应面试验结果见表4。

表4 响应面试验结果Table 4 The results of response surface test

由表5 中可看出，模型回归极显著，失拟项不显著，说明模型是有效的，可以很好地分析数据；该模型R2=0.979 3，R2Adj=0.952 6，说明模型拟合程度高，能拟合97.9%的实验数据，较好地反映各因素与提取率之间的关系；可以用此模型来确定火龙果花黄酮的最佳提取工艺条件。三个因素的一次项均达到了显著或极显著水平，说明三个因素对黄酮提取率影响显著，线性效应明显；液料比与酶解时间的二次项对黄酮提取率极显著（P＜0.01），说明对黄酮提取得率影响较大；从F值可以看出，对黄酮提取率影响最大的是酶解时间，其次是乙醇体积分数。

表5 Box-Behnken 方差分析表Table 5 Box-Behnken analysis of variance

2.3.2 响应面各因素间的交互分析

从图6（见下页）中可看出，火龙果花黄酮提取率随液料比的增大先升高后下降，随乙醇体积分数的增大而升高；乙醇提取分数的曲面坡度较液料比的曲面陡，即乙醇浓度曲面倾斜度高，说明乙醇体积分数对黄酮提取率的影响大于液料比；等高线为椭圆形，说明液料比和酶解时间交互作用较强；随酶解时间的延长与液料比的增大，火龙果花黄酮提取率均呈先升高后降低的趋势；液料比曲面坡度较酶解时间的曲面平缓，说明液料比对黄酮提取率的影响小于酶解时间，这与方差结果一致。火龙果花黄酮提取率随酶解时间的延长先升高后下降，随乙醇体积分数的增大而升高；酶解时间曲面倾斜度高，说明乙醇体积分数对黄酮提取率的影响小于酶解时间。

图6 不同因素交互作用对黄酮提取得率的响应面图Fig.6 Response surface graphs of the interactive effects from different factors on the yield of flavonoids

2.3.3 最佳工艺条件

通过Design-Expert 12 软件的响应面优化得到火龙果花黄酮提取率的理论值最大为10.36%，最佳条件为液料比48.07∶1（mL/g）、乙醇体积分数79.99%、提取时间62.84min。为便于实际操作，调整液料比48∶1（mL/g），乙醇体积分数80%，酶解时间63 min。依照此工艺条件进行5次重复试验，得到火龙果花黄酮的提取率为10.28%，与预测值接近，说明Box-Behnken 设计响应面法得到的提取条件可靠，可用来预测火龙果花黄酮的提取得率。在此条件下黄酮提取率高于李国胜等[10]和罗小艳等[12]研究结果，说明复合酶-超声波辅助提取方法比上述方法的黄酮提取率高。

2.4 火龙果花黄酮抗氧化活性测定

由图7 可知，火龙果花黄酮提取液和VC 溶液对ABTS＋·清除率变化一致，随着质量浓度的增加，对自由基清除率上升；在黄酮提取液浓度为1.2 mg/mL 时，对ABTS＋·清除率为45.65%；说明火龙果花黄酮能提供较多的活性氧，从而更多的ABTS＋·被清除[19-21]。在同一质量浓度下，VC 溶液对这两种自由基的清除能力高于火龙果花黄酮提取液，说明火龙果花黄酮提取液具有一定的抗氧化性，但比VC 抗氧化性弱。

图7 火龙果花黄酮对ABTS＋·的清除率Fig.7 ABTS＋·scavenging rate of flavonoids in pitaya flower

超氧阴离子可以使细胞的膜相系统发生脂质过氧化，生成其他氧自由基，从而损伤机体引起疾病[19]。由图8可知，火龙果花黄酮提取液和VC 溶液对超氧阴离子的清除率随着质量浓度的增大而升高；火龙果花黄酮提取液在0.15～1.20 mg/mL 时，其清除率从21.67%上升到39.67%；火龙果花黄酮提取液对超氧阴离子的清除率低于同一质量浓度VC 溶液的。

图8 火龙果花黄酮对超氧阴离子的清除率Fig.8 Superoxide anion scavenging rate of flavonoids in pitaya flower

3 结论

本研究建立了复合酶-超声波辅助提取火龙果花黄酮的方法。在单因素试验基础上，经Plackett-Burman 试验筛选出对火龙果花黄酮提取率影响显著的三个因素为液料比、乙醇体积分数和酶解时间。通过响应面优化得到火龙果花黄酮提取的最佳条件为液料比48∶1（mL/g），乙醇体积分数80%，酶解时间63 min，在此优化条件下黄酮提取率为10.28%；火龙果花黄酮有较好的抗氧化作用，可以作为食品、日化品与药品的原料，为提升火龙果花制品的附加值提供更多途径，合理利用果品废弃物，使之变废为宝，延长产业链，促进火龙果产业蓬勃发展。