一株黄喉拟水龟致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏分析

周 晗,黄 瑜,简纪常,蔡 佳,黄浦江

(1.广东海洋大学水产学院/广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室,广东湛江 524088;2.深圳市渔业发展研究中心,广东深圳 518108)

黄喉拟水龟(Mauremysmutica),别名石金钱,隶属爬行纲(Reptilia),20世纪80年代以后被引入日本,成为外来入侵种。与世界许多生物一样,过度捕猎和栖息地丧失等因素导致其野生资源几近枯竭。现如今规模化养殖目前已经形成,在饲养过程中,黄喉拟水龟易发生大规模暴发性疾病,病龟食欲不振,行动迟缓,器官受病菌感染,最终衰竭死亡,给养殖户带来极大的经济损失。资料显示,黄喉拟水龟曾在2000和2016年均被记录为濒危物种,在2010年被记录为极度濒危物种[1],在国际贸易中受到严格管控[2]。黄喉拟水龟的食用、药用和观赏价值较高,在人工养殖条件下,细菌类疾病是导致黄喉拟水龟发病的主要原因[3]。目前,有关龟类的病害防治受到重视,不同症状的龟类其病原菌的鉴定结果不同。王苗等[4]曾在草龟身上分离出一株致病菌,经鉴定结果为维氏气单胞菌的一株;时少坤等[5]于患有红脖子病黄喉拟水龟中分离到嗜水气单胞菌。已有相关报道表明维氏气单胞菌已逐渐成为威胁人类健康的重要病原菌[6],维氏气单胞菌可污染畜禽等肉类、水产品、人,可引发人患胃肠炎、腹膜炎、脑膜炎、败血症、泌尿道和外伤感染。国内外对维氏气单胞菌的研究与其他人畜共患的病原菌相比并不成熟[7]。广东省深圳市福田区某养殖场患病龟主要症状有食欲不振、精神萎靡、行动迟缓、眼睛肿大、充血、全身或局部感染、排便增多、水便、急性腹泻等,身体伴有明显异味。笔者对从原始发病黄喉拟水龟的肺、脾脏、肝脏中进行病原菌分离,经生理生化试验、16S rDNA序列分析动物回归感染试验判断其生物学地位及致病性,并通过药敏试验分析病原菌的药物敏感性,以期为控制该病原菌感染和致病机理研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料对广东深圳某养龟场患病黄喉拟水龟采样并采购同一养殖场的健康黄喉拟水龟(体重80～90 g),实验室条件下饲养15 d确定健康后用于回归感染试验。

革兰氏染色试剂盒、培养基、细菌生理生化鉴定试剂盒、药敏试剂盒购自广东环凯微生物科技有限公司;分子生物学测序鉴定分析由华大基因科技有限公司完成。

1.2 病原菌的分离纯化无菌条件下,从肺、脾脏、肝脏病灶组织进行细菌分离纯化,在营养琼脂(NA)培养基上划线[8],28 ℃过夜培养,挑取生长良好、形态规格一致且数量多的菌落进行传代培养,并进行后续鉴定分析。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1革兰氏染色。挑取单克隆菌落涂布在滴有无菌生理盐水的载玻片上,自然风干,在酒精灯火焰上固定加热。按照革兰氏染色试剂盒说明书进行染色观察。

1.3.2生理生化鉴定。生理生化试验按照环凯科细菌生化编码鉴定管试剂盒说明书进行。

1.3.3细菌16S rDNA鉴定。用CTAB法提取单克隆菌落的DNA,利用华大基因科技有限公司合成的16S rDNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测[4],随后将PCR产物送至华大基因科技有限公司进行序列测定。

1.3.4构建系统发育进化树。利用NCBI的BLAST功能进行测序获得的16S基因比对分析并进行系统进化树构建。

1.4 病原菌药敏试验将目标病原菌画线接种于NA培养基,28 ℃过夜培养至稳定期,挑取3～5个菌落于1 mL灭菌生理盐水,振荡均匀,用无菌棉签沾取菌液均匀涂布于MH固体培养基中,每个平板均匀贴布5片药敏片,28 ℃培养箱过夜后观察并测量,根据说明书对比抑菌圈的直径来判断对抗生素的敏感程度。

1.5 病原菌感染试验试验龟用无菌生理盐水清洗。将已培养至稳定期病原菌株,用分光光度计进行菌液浓度测定,并根据陆专灵等[9]的方法用无菌磷酸盐(PBS)缓冲液将菌液稀释成109、108、107、106、105、104、103CFU/mL 7个梯度,腹腔注射龟体,每组8只,每只100 μL,对照组注射等量PBS缓冲液100 μL,接种后观察龟的发病情况,并分离鉴定病原菌和重复感染试验。

2 结果与分析

2.1 患病黄喉拟水龟剖检自然患病黄喉拟水龟腹甲肿胀,剖检后体内肝脏充血变脆并伴有腐臭,脾、肠道等器官充血(图1)。

注:a.健康未感染龟;b.脾脏充血;c.肝脏肿胀变脆;d.肺部出血;e.肺部肿大;f.消化道充血。Note:a. Healthy, uninfected turtles; b.Hyperemia of the spleen;c.The liver becomes swollen and brittle;d.Bleeding in the lungs;e.Lung enlargement; f.Hyperemia of the digestive tract.图1 患病死亡黄喉拟水龟剖检Fig.1 Necropsy of diseased and dead Mauremys mutica

2.2 生理生化鉴定从患病黄喉拟水龟病灶分离纯化出数量最多、长势最好的菌株,命名为GZW01;革兰氏染色结果显示为杆状,革兰氏阴性菌(图2),在普通固体琼脂培养基上形成圆形,光滑,边缘整齐,灰白色菌落(图3)。

图2 分离菌株革兰氏染色Fig.2 Gram staining of isolated strain

图3 菌落形态 Fig.3 Colonial morphology

将分离纯化后的单菌落接种于生化鉴定管,37 ℃培养24～48 h后进行观察(不同项目培养时间不同,需参照说明书),菌株GZW01的VP试验、MR试验阳性,3% NaCl三糖铁试验显示不能产生硫化氢,能分解蔗糖、葡萄糖;氧化酶阳性;覃糖、1% NaCl甘露醇、1%NaCl甘露糖、1%NaCl肌醇反应结果呈阳性等生理生化特性(表1)与《伯杰氏细菌鉴定手册》中关于维氏气单胞菌的鉴定结果相同[10]。将测序序列在NCBI进行同源比对显示与维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)同源性达99%(图4)。综上结果,菌株GZW01可鉴定为维氏气单胞菌。

表1 分离菌株GZW01的生理生化特征

图4 基于16S rDNA序列的维氏气单胞菌GZW01的系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic evolution tree of Aeromonas vibrio GZW01 based on 16S rDNA sequences

2.3 病原菌药敏试验GZW01分离菌株对抗生素(35种)敏感性结果(表2)显示,菌株对庆大霉素、红霉素、氧氟沙星、氨曲南等药物高度敏感,数量为28种;对克拉霉素药物中度敏感;对青霉素G、苯唑西林、氨苄西林、四环素、万古霉素、克林霉素耐受。

表2 GZW01药敏试验

2.4 病原菌感染试验腹腔注射菌株GZW01,攻毒7 d后各组黄喉拟水龟死亡情况如表3所示。根据兰云等[10]的方法计算出7 d半致死浓度(LD50)为3×107CFU/mL。

表3 菌株GZW01对健康黄喉拟水龟感染试验结果

3 结论与讨论

该研究从患病龟的肝、脾等组织分离出优势菌株后,经16S rDNA序列比对和生理生化鉴定相互佐证,并构建系统发育树,鉴定结果表示GZW01为维氏气单胞菌的一株;在回归感染试验中,菌株感染黄喉拟水龟后的发病症状与养殖场原始患病龟症状相同,因此可判断该菌(GZW01)是引起黄喉拟水龟突发死亡的主要致病菌。该研究回归感染维氏气单胞菌,其LD50为3×107CFU/mL,说明该菌对黄喉拟水龟具有较强致病力。

该研究分离的维氏气单胞菌(A.veronii)对青霉素G、苯唑西林、氨苄西林、四环素、万古霉素、克林霉素6种药物耐受,可能与水体污染有关。此外,高度敏感的抗生素有红霉素、复方新诺明、氧氟沙星、氨曲南、庆大霉素、麦迪霉素等28种,因此,抗生素用药有了更多选择。不同地区来源的细菌对抗生素耐药性有所不同,这有可能与菌株来源有关[11]。维氏气单胞菌是近年来新发现的人畜鱼共患病原菌之一,广泛分布于淡水、咸水、淤泥等各个水域。当A.veronii感染水生动物可引发溃疡、内脏充血肿大和腹水等,会对水产养殖业造成巨大经济损失。人接触或食用了未消毒或加热不够彻底的水产品时,极易感染,其症状多表现为腹泻、发热,严重可导致人脑膜炎和败血症等。有研究表明维氏气单胞菌会感染养殖经济鱼类[7];有研究者从患病草鱼肝脏中分离到的一株维氏气单胞菌具有很强的溶血毒性,高致死率[12];另外,也有报道贵州曾发现一起草龟突发性死亡,通过细菌分离和鉴定发现为致病性维氏气单胞菌[4]。以上报道暴发时间在9月,该研究发现此次暴发与之前报道时间相近,夏季水温、天气和水质等因素[13]突变影响,增加了细菌感染[14]及疾病暴发概率。在此次研究试验中发现,维氏气单胞菌对营养生存环境需求极低,在27～28 ℃生长较为活跃,且在低温下也能保持缓慢增长。因此,该菌对水体以及水生动物的感染并不完全受控于气候和天气。

目前水产养殖中,细菌感染常呈现集中高暴发性,原则上抗生素是应对细菌性疾病的极有效方法,然而与人体一样,滥用抗生素会导致水产动物耐药性增强,水环境不均衡,细菌也会出现高耐药性的变异,因此在水产养殖过程中,原则上应结合不同来源菌株的药敏试验结果,合理选取抗生素,尽量减少多重耐药性菌株的产生。抗生素会在水生动物体内残留,并对养殖水体和环境具有一定的破坏[15-16]。国内外学者为了预防和控制A.veronii,开发了口服疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗等[17]。虽然,多种疫苗有一定的免疫效果,但仍处于实验室研发阶段,针对不同宿主来源的病原缺乏充分的预防和控制能力。因此不同地区的病例要结合药敏特性试验结果对症下药,也应加强无残留、无耐药性的替代品的研发以取代抗生素,为全国水产养殖业的科学健康发展提供依据。该试验中的患病黄喉拟水龟并非有年龄限制,成年龟与幼龟均存在,由于物种的特殊性,黄喉拟水龟一旦暴发严重的细菌性疾病,将对养殖户造成金钱与时间上的巨大损失,因此对维氏气单胞菌的有效防治药品的研发刻不容缓。