鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢生长性能、抗病力以及肠道抗氧化能力的影响

■ 李若铭 陈秀梅 田佳鑫 孔祎頔 韩明铭 任义波 王桂芹*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2.吉林省水产科学研究院，吉林长春 130033；3.淮安禾丰饲料有限公司，江苏淮安 223005）

乌鳢（Channa argus）作为我国重要的淡水经济鱼类，又称黑鱼、火头、财鱼等，因其生长快、没有肌间刺、生命力强等优势，深受消费者的青睐[1-4]。随着集约化养殖环境的发展，水环境受到了污染，养殖者为了满足市场对水产品的需求，错误地投喂高糖高脂饲料以及因储存不当导致的霉变饲料，破坏了乌鳢的养殖环境，增加了乌鳢肠道对细菌的易感性，使其健康受到了严重的威胁，进而降低了乌鳢的经济效益[5]。于是，为了解决这些问题，养殖者们大量使用化学药物并滥用抗生素，这不仅会导致药物在水产动物体内残留，而且还会引起多种耐药菌株的增加，阻碍了水产养殖的绿色发展，同时，对水产品的质量也产生了不良影响[6]。农业农村部第194号公告的颁布，宣布了我国的“全面禁抗”时代已经到来，寻求绿色、经济、有效的替抗物质是水产养殖的重点研究方向，这对水产养殖业的健康发展具有重要意义。中药具有高效、副作用小、不易产生抗药性等优势，是一种安全的饲料添加剂[7-8]。但由于中药的加工工艺，使饲料的适口性变差，为了寻求效果更佳、残留更少的替抗产品，经过益生菌的发酵后，中药的有效成分充分释放，同时改善饲料的适口性，发酵后具有绿色、环保、无污染的优点。因此，益生菌发酵中草药的应用与开发已成为国内外开展替抗研究的热点之一[9-10]。但是益生菌发酵中药作为新兴替抗产品在水产养殖业的应用较少，因此，本试验以乌鳢为研究对象，利用鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）发酵复方中草药，探究发酵中药对乌鳢生长性能和肠道抗氧化及抗病力的影响，旨在为乌鳢的健康养殖和绿色发展以及发酵中药在水产养殖业的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌的活化、复方中药液和发酵产物的制备

试验用L.rhamnosus、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）由吉林农业大学预防兽医实验室提供。将L.rhamnosus进行活化，传代培养后并进行菌落计数，并将菌落数调整至1×108CFU/mL。

从吉林大药房购买试验用黄连、木香、苍术，洗净后放置65 ℃烘箱中烘干，粉碎后过80目筛，苍术∶黄连∶木香为6∶3∶2比例混合为复方中药，精准称取10 g，加10倍体积水浸泡4 h，煎煮1 h，纱布过滤药液至锥形瓶中。将上述所得复方中药水体液，弃沉淀分装，115 ℃灭菌15 min，即得制备好的复方中药液，保存于4 ℃冰箱中备用。

取制备好的复方中药液置于发酵罐中，加入活菌数为1×108CFU/mLL.rhamnosus，通过前期发酵优化试验参数：发酵温度37 ℃，发酵时间48 h，按此发酵条件制备发酵液，将发酵液过滤后获得发酵产物放置4 ℃冰箱中备用。

1.2 饲料的制备

在基础饲料中（见表1）分别添加0（对照组，无添加）、复方中药、L.rhamnosus（1×108CFU/mL）、发酵中药，配制成4种等氮等脂的试验饲料（见表2）。利用海藻酸钠与饲料进行混合，并置于烘干箱内37 ℃烘干，烘干后进行菌落计数，在25 ℃空调房晾干，每3 d准备一批新的饲料，保存在自封袋中4 ℃冷藏，以保持L.rhamnosus的活性，每天检测制备的饲料中L.rhamnosus活性。

表1 基础饲料配方及营养水平（干物质基础）

表2 试验设计

1.3 试验设计及日常管理

购自山东临沂某养殖场的乌鳢，暂养驯化14 d后，选取360尾体质健康、大小一致的乌鳢，随机分成4组，每组3个重复，每个重复30尾。养殖期间日常管理及水质条件同暂养期间保持一致，水温26～28 ℃，溶解氧大于5 mg/L，pH（7.1±0.1），氨氮含量<0.5 mg/L，亚硝酸盐含量<0.05 mg/L，每日饱食投喂两次（09：00、16：00）。

1.4 样品收集

饲养8 周试验结束后，禁食24 h，计数并称重。每桶随机抽取10 尾鱼，用MS-222 麻醉后，冰上解剖取肠道液氮速冻后置于-80 ℃保存待测。

1.5 指标测定

根据记录的乌鳢初重、末重，按照常规公式计算平均增重率（WG）、特定生长率（SGR）、成活率（SR）和饲料效率（FER）。

乌鳢肠道超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成生物技术研究所有限公司试剂盒检测，按照说明书进行操作。

乌鳢肠道SOD、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、紧密连接claudin-3 及闭合小环蛋白-1（ZO-1）mRNA 表达水平采用荧光定量PCR法检测，引物序列见表3。

表3 引物序列

饲养试验8 周后，禁食2 d 后，腹腔注射100 μLA.hydrophila（1×107CFU/mL），攻毒后观察14 d，记录死亡情况，计算相对存活率评价保护效果。

存活率（RS，%）=（1-各组死亡鱼总数/各组内鱼总数）×100

1.6 数据统计

所有数据均采用SPSS 20.0 统计软件单因素方差分析（ANOVA）统计组间差异，并用Duncan’s 多重比较检验各处理组差异，数据均以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢生长性能的影响

由表4可知，复方中药、L.rhamnosus和发酵中药的添加使乌鳢的末重、WG、SGR和FER 显著高于对照组（P<0.05），而存活率无显著差异（P>0.05）。复方中药组和L.rhamnosus组的这些指标均无显著差异（P>0.05）。

表4 鼠李糖发酵中药对乌鳢生长的影响

2.2 鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢肠道抗氧化能力的影响

由图1（A）和（C）可知，饲养试验结束后，饲料中添加L.rhamnosus和发酵中药组乌鳢肠道中的SOD和GSH-Px 活性均显著高于对照组（P<0.05），而复方中药组SOD 和GSH-Px 活性与对照组相比差异不显著（P>0.05）。由图1（B）可知，复方中药、L.rhamnosus和发酵中药组乌鳢肠道中的CAT 活性均显著高于对照组（P<0.05），其中发酵中药组达到最高。由图1（D）可知，与对照组相比，所有试验组乌鳢肠道中的MDA 含量均显著降低P<0.05），其中，且发酵中药组达到最低。由图2可得，与对照组相比，发酵中药的添加显著提高SOD、GST、claudin-3及ZO-1的表达量（P<0.05）。SOD和claudin-3表达量在L.rhamnosus组和复方中药组之间无显著差异（P>0.05），L.rhamnosus组和发酵中药组之间无显著差异（P>0.05），而复方中药组和发酵中药组之间有显著差异（P<0.05）。GST的表达量在L.rhamnosus组和复方中药组之间无显著差异（P>0.05），而与发酵中药组之间有显著差异（P<0.05）。各组之间的ZO-1表达量均有显著差异（P<0.05）。

图1 鼠李糖发酵中药对乌鳢肠道抗氧化的影响

图2 鼠李糖发酵中药对乌鳢肠道mRNA相对表达量的影响

2.3 鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢抗病力的影响

由图3 可知，对照组在攻毒后7 d 内全部死亡，经过14 d的观察，复方中药组、L.rhamnosus组以及发酵中药组的死亡率低于对照组，死亡率分别为55%、50%、25%。

图3 鼠李糖发酵中药对乌鳢抗病力的影响

3 讨论

3.1 鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢生长性能的影响

发酵中药作为饲料添加剂已成为当下的研究热点，在畜禽动物的研究中均证实发酵中药的添加会提高饲料利用效率，同时具有提高动物机体免疫力和抗氧化的能力[11-12]。中药是一种兼具营养和药用的天然传统植物，益生菌是一种能够促进生长、提高抗氧化和抗逆性的活性微生物，二者具有协同作用[13-14]。发酵后，具有无抗药性、安全高效等优势，发酵中药能够释放出更多有效成分，增强其原有的性能，促进活性成分更好地被吸收利用。中药经过发酵后，一方面，抗营养因子被有效的降解、饲料的适口性得到了优化，进而提高了饲料的利用效率；另一方面，发酵会产生不同类型的有机酸、生物碱、黄酮类等丰富的营养物质，具有增进食欲、增强诱食效果的作用[15-16]。本试验的结果证明了这一结论，虽然饲料中添加益生菌和复方中药均能够促进乌鳢的生长，但是发酵中药组的乌鳢WG 更高，促进生长的效果更显著。在对其他鱼的研究上得出了相似的结论，齐国山等[17]在南北白对虾（Penaeus vannamei）的饲料中添加了不同浓度的发酵中药连续投喂45 d，研究表明，添加1.0%～4.0%的发酵中药均显著提高了南美白对虾的末重、WG 和SGR，但是不同发酵中药的添加量之间差异不显著。陈秀梅等[18]用添加乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）发酵复方中药的饲料投喂乌鳢，研究乳酸乳球菌与复方中药的发酵产物对其生长性能的影响，结果表明，中草药发酵物能够显著提WG 和FER。谢炎福等[19]研究结果表明，与复方中药组相比，中剂量发酵组的黄河鲤（Cyprinus carpio）WG 提高了11.7%，饵料系数降低了8.1%。由此可见，益生菌与复方中药的发酵产物能够促进生长，对水产动物具有营养价值。

3.2 鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢肠道抗氧化的影响

肠道不仅能够消化吸收，而且具有免疫功能、屏障功能等作用，氧化应激与很多的综合征相关，其中肠道受到氧化损伤的几率更高且危害更大[20-21]。氧化应激会使水产动物的肠道黏膜受损，降低分泌吸收功能，同时，影响通过肠细胞信号转导的增殖分化和凋亡等过程。因此，水产动物受到氧化应激会导致细胞受损，降低免疫力，对水产养殖造成严重的经济损伤。中药经过发酵后，不仅可以保持原有菌株的优势，而且能够抑制病原菌繁殖生长；同时，清除自由基、调节肠道的菌群平衡，从而达到保护肠道健康的效果[22]。SOD、CAT、MDA、GSH-Px 和GST 作为评价机体抗氧化能力的主要指标，均在应对氧化应激的过程中发挥重要功能[23]。SOD、CAT和GSH-Px能够有效清除机体自由基，MDA是检测机体氧化状态的标准指标，过多的自由基产生就会攻击细胞产生MDA，破坏机体的抗氧化屏障。孟欣等[24]研究干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵人参茎叶提取物对锦鲫（Carassius auratus）抗氧化功能的影响，结果表明，添加5%的益生菌发酵中药组的SOD、CAT 和GSH-Px 活性显著高于对照组，而MDA 含量显著低于对照组，这与本试验结果一致。以上结果均可表明，益生菌与中药共发酵产物可以清除鱼体内蓄积的自由基，增强鱼类的抗氧化能力。鱼体受到应激时，肠道的紧密连接结构被破坏，病原菌侵入肠腔，会导致肠道损伤，进而加重肠道屏障功能损伤[25]。而肠道紧密连接蛋白能够调节细胞旁通透性和维持细胞极性，对肠道屏障保护具有重要意义，主要为封闭蛋白（Claudins）和跨膜蛋白与闭合小环蛋白（ZOs）[26-27]。Claudin-3作为紧密连接蛋白家族极具代表性的基因，Claudin-3表达量的下降会造成肠道通；ZO-1 与多种紧密连接蛋白联系密切，而且在胞内通路的信号传输方面发挥着关键作用。研究表明，益生菌和中草药的添加都能够改善紧密蛋白结构受损情况，降低肠上皮细胞间的通透性、阻挡病原菌的进入，进而有效保护鱼类肠道屏障功能[28-30]。益生菌和中药具有协同作用，经过发酵后，效果更佳。尽管发酵中药对保护肠道健康方面具有巨大潜力，但是对于肠道健康的调控机制仍然缺乏，还需要深入研究。

3.3 鼠李糖乳杆菌发酵中药对乌鳢抗病力的影响

发酵中药在动物疾病防治方面发挥重要作用，因此，发酵中草药是一种安全的抗生素替代品，对绿色健康水产养殖的发展具有重要意义。中药和益生菌在抑菌和免疫调节中均有良好的效果，二者相互作用，中药为益生菌的生长繁殖提供营养物质，而益生菌通过氧化、甲基化等生物反应，对阻碍有效成分释放的中药细胞壁进行消化，释放更多有效活性物质且产生更多的活性成分，进而增强药效、减少用量，从而缩短有效成分达到有效浓度的时间以及提高动物机体的免疫力和抗病力[31-35]。本试验攻毒嗜水气单胞菌后观察并记录死亡情况，结果表明，鼠李糖乳杆菌发酵中药能够有效地阻止病原菌的侵袭，降低乌鳢的死亡率，提高相对免疫保护率。本试验结果进一步证实了中药发酵后不仅可以分泌更多的抑菌物质，而且可以通过营养争夺的方式抑制病原菌的生长[19，36]。李永娟等[37]研究表明投喂发酵中药的饲料，能够提高草鱼（Ctenopharyngodon idella）抗嗜水气单胞菌能力。汤菊芬等[38]用含哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的水浸泡凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），对照组和发酵组的死亡率分别为93.33%、31.11%，说明在饲料中添加发酵中药提高了水产动物的成活率，促进了水产养殖业的健康发展。但目前，益生菌和中药的种类繁多、来源广泛，使发酵产物具有差异性，导致发酵产物的功能和效果大不相同，因此，筛选不同功效的发酵中药作为水产饲料添加剂需要进一步地探究，且发酵中药的作用机制也需深入研究。

4 结论

综上所述，本试验条件下，鼠李糖乳杆菌与复方中药共发酵产物不仅能够促进乌鳢的生长和肠道健康，而且在遭受细菌感染时，具有更高的存活率。