脂肪干细胞来源外泌体对膝骨关节炎作用机制的研究进展

王小强　谢兴文　赵军　徐世红　王兴盛　姜朝阳　丁聚贤　马亚文　张淑秀　刘佳　白雪

【摘 要】 目前，治疗膝骨关节炎的方式多样且有效，但同时并发症比较明显。近年来，外泌体作为一种新的治疗方式被关注，并且表现出巨大的临床潜力。阐述膝骨关节炎与外泌体的关系，并介绍脂肪干细胞来源外泌体在免疫调节、成骨分化、细胞自噬三个方面的优势，旨在为临床治疗膝骨关节炎提供新思路、新方法。

【关键词】 膝骨关节炎；外泌体；脂肪干细胞；免疫反应；自噬；研究进展；综述

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是导致老龄人群膝关节疼痛和残疾的主要原因之一。膝关节软骨病变和破坏，膝关节退行性改变、损伤，关节内应力失衡，软骨下骨硬化和其他结构的破坏及修复之间的平衡失调是导致本病发生、发展的主要原因。KOA的症状和体征包括疼痛、僵硬、关节活动减少和肌肉无力［1］。流行病学研究表明，约30%的成年人有骨关节炎的放射征象，8.9%的成年人有临床意义的膝关节或髋关节骨关节炎，其中KOA是最常见的类型［2］。我国一项基于全国人口的研究显示，有症状的KOA总发病率为8.1%，且随着年龄的增长KOA患病率不断增加［3-4］。与KOA风险增加相关的因素包括年龄、性别、超重或肥胖、膝关节损伤、职业因素（如膝关节弯曲、重物搬运和下蹲），以及内翻或外翻等。KOA长期发展带来的后果包括身体活动减少、病情恶化、睡眠受损、疲劳、抑郁和残疾等。

目前，KOA的治疗可分为非手术治疗和手术治疗。非手术治疗包括非药物和药物治疗，非药物治疗包括针灸、红蓝光照射、射频电疗等，药物治疗包括口服非甾体抗炎药，中药外敷、中药塌渍、中药涂擦，以及关节腔内药物注射。治疗存在一定的不良反应，如关节腔注射无法促进退变软骨的修复或阻断疾病发展的进程，且关节腔内注射治疗KOA存在较大的争议［5］；非甾体抗炎药长期使用会增加胃肠道出血、穿孔和心血管疾病的风险［6］；外科手术是终末期KOA的最后手段，但存在术后伤口感染、屈伸活动受限等风险。基于此，临床迫切需要一种新的治疗方法降低或者消除药物治疗带来的不良反应。

1 外泌体

学者最早发现一种在成因、大小、成分等方面有独立特点的细胞外囊泡，该细胞外囊泡包括凋亡小体、微泡及外泌体（直径30～150 nm），于是将其单独分出来，外泌体含有信使RNA（mRNA）、微小核糖核酸（miRNAs）、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）等多种核糖核酸分子，以及脂类、蛋白质、氨基酸等多种生物活性分子［7-8］。几乎所有的细胞都能分泌外泌体，可通过其携带的生物活性大分子调节受体细胞的生物学活性，并参与细胞分化、迁移免疫应答等方面的信号传递，此外还参与细胞因子、mRNA、miRNAs和蛋白质等生化物质的转运，并且通过遗传物质的转移在细胞间通信中发挥关键作用［9］。由于外泌体比干细胞小得多，很容易在体内循环并到达损伤部位，这样便能避免大多数与细胞治疗相关的问题。此外，外泌体的长期重复给药不会引起毒性。来源于干细胞的外泌体是细胞治疗的一个有前途的替代物［10］。

2 外泌体与KOA的联系

外泌体作用广泛，已被用于多种临床研究。不同组织来源外泌体对KOA均有明确的治疗作用，能够减少软骨内炎症因子的产生，促进软骨基质合成，延缓KOA进展［11］。关节软骨细胞来源外泌体可介导软骨细胞与靶细胞间的信号转导；关节滑膜组织来源外泌体以及肌腱干细胞产生的外泌体可促进软骨细胞分化和增殖，并抑制白细胞介素家族及肿瘤坏死因子-α等炎症因子表达，同时抑制软骨细胞凋亡［12］；间充质干细胞来源外泌体通过旁分泌的作用参与调节多项生理及病理过程，其中包括免疫反应、血管生成、骨形成等。综上所述，外泌体参与KOA的病理过程，而脂肪干细胞来源外泌体（ADSCs-Exos）对于KOA作用机制也逐渐被挖掘出来。

3 ADSCs-Exos

ADSCs-Exos来源广泛且容易获得，因其具有多能分化潜能、增殖生长、旁分泌效应、免疫调节特性和更好的安全性，已成为组织再生、免疫调节和促进修复中最有前途的替代物之一。近年来，脂肪干细胞已成为组织工程领域的研究热点。脂肪干细胞的多能体潜在作用主要依赖于旁分泌介导的机制，这种作用被认为是通过分泌多种物质来实现的，如可溶性细胞因子、生长因子、功能性蛋白质、脂质、微小核糖核酸、低分子量核糖核酸和细胞外囊泡［13］。而来自旁分泌脂肪干细胞，即ADSCs-Exos在细胞间通讯中作为介质发挥前所未有的作用［14］，不仅模拟了原始细胞的能力，而且可以有效避免有限的细胞存活、介导免疫反应、促进成骨分化、促进细胞自噬，从而发挥治疗作用［15］。

3.1 介导免疫反应 炎症是经典创伤修复4个阶段中最早的反应，发生在缺血状态下的24～48 h。

早期伤口愈合过程中会出现不同程度的炎症反应，适度的炎症反应有利于清除炎症因子，对抗感染，清除细胞碎片，从而修复受损组织；不良的炎症环境是慢性伤口发展的主要危险因素［15］。ADSCs-Exos通过调节免疫细胞以及炎症因子释放，发挥免疫调节功能［16］。KRUGER等［17］探索同种异体脂肪组织来源的间充质干细胞条件培养基对抗持续炎症功效的研究，首次阐明了ADSCs-Exos在免疫受损的肥胖个体中恢复炎症平衡的治疗潜力。ZHAO等［18］发现，ADSCs-Exos通过携带有活性的反式激活精氨酸酶诱导巨噬细胞向抗炎表型转化，从而减轻炎症和胰岛素抵抗，发挥调节免疫和代谢稳态的作用。ADSCs-Exos可促进原始CD4+ T细胞（淋巴细胞分类中的T辅助细胞）分化为辅助性T细胞和调节性T细胞，降低炎症性T细胞应答，减少炎症因子的产生［19］。

另一项研究发现，ADSCs-Exos降低促炎细胞因子水平，增加促血管生成因子，促进内皮细胞的增殖、迁移和管状形成，从而加快血管的生成［20］。崔晓等［21］提出，体内因素（如激素水平异常、免疫力低下、周围肿瘤组织、局部供血不良等）和体外因素如護理不当时，就会导致创面内炎症反应增加，使创面愈合过程停滞在炎症期，ADSCs-Exos能够抑制炎症反应，缩短创面的修复时间。彭译萱等［22］研究发现，ADSCs-Exos可使创面表皮生长因子、血管内皮生长因子表达水平显著升高，炎症细胞浸润减弱。ADSCs-Exos对T淋巴细胞有抑制作用，影响其细胞增殖过程，削弱免疫反应，推动创面修复过程由炎症期向增殖期过渡，加速愈合进程［23］。

3.2 促進成骨分化 关节软骨由软骨细胞合成和分泌，是一种由软骨细胞和细胞外基质组成的结缔组织。包裹软骨细胞的基质对软骨关节起到润滑和机械支撑的作用。虽然软骨细胞只占软骨总体积的1%，但它在维持基质的完整性方面发挥着不可替代的作用。KOA涉及整个关节结构，包括关节软骨、滑膜、韧带、软骨下骨和关节周围的肌肉，关节软骨基质分解代谢与合成代谢失衡是形成本病最本质的原因［24］。抑制或延缓软骨细胞被破坏，调节关节软骨基质分解代谢与合成代谢成为治疗的关键点。ADSCs-Exos对成骨的促进作用归因于4个机制：一是在缺血和坏死微环境中减少凋亡的保护作用；二是趋化和增殖作用，以募集间充质干细胞并促进其增殖；三是促进血管形成的血管生成效应；四是直接发挥骨诱导作用，直接促进成骨分化。外泌体的前3种机制似乎来源于其母细胞的内在功能。当ADSCs-Exos应用于骨组织工程时，第4种机制为骨诱导效应随之发生［25］，ADSCs-Exos在体外促进了细胞的迁移、增殖和成骨分化。

李婧等［26］生化检测研究结果显示，实验组细胞内的碱性磷酸酶活性高于对照组，提示ADSCs-Exos可能提高人牙髓干细胞成骨分化能力，促进成骨细胞的产生。ADSCs-Exos更高效被同源细胞即脂肪干细胞摄取，经成骨诱导的ADSCs-Exos可以促进未分化脂肪干细胞成骨分化［27］。经典Wnt/β-catenin通路是参与干细胞成骨分化的重要通路之一。在脂肪干细胞成骨分化过程中，Wnt家族发挥重要作用［28］。β-catenin是此通路中关键调节分子，广泛存在于细胞质内，受到Wnt信号激活后转入细胞核内，调节目标基因［29］，促进脂肪干细胞成骨分化。崔梦莹等［30］提取人脂肪干细胞，形成骨诱导后提取外泌体，按实验目的分组处理后，检测成骨标记物碱性磷酸酶活性，茜素红检测矿化程度，Western Blot检测各组β-catenin蛋白表达情况，得出ADSCs-Exos能够通过Wnt/β-catenin信号通路促进脂肪干细胞成骨分化。朱梦茹［31］通过酶消化法分离培养原代脂肪干细胞并进行鉴定，超速离心法提取脂肪干细胞未成骨诱导，成骨诱导外泌体后进行相关实验，发现脂肪干细胞成骨诱导分泌的ADSCs-Exos能够被原始脂肪干细胞高效摄取，并且进入细胞内独立作用诱导脂肪干细胞增殖、迁移，成骨分化。吴江怡［32］通过给KOA模型小鼠注射髌下脂肪垫干细胞来源的外泌体后发现，髌下脂肪垫干细胞外泌体可保护KOA小鼠软骨，并改善小鼠的异常步态。此外，髌下脂肪垫干细胞外泌体可促进KOA软骨细胞增殖、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨基质的合成，并增强KOA软骨细胞的自噬水平。

3.3 促进自噬 关节软骨是肌肉骨骼系统的组成部分，在关节运动过程中吸收压缩力和剪切力，软骨老化和结构变化的发展与细胞稳态机制的失败有关，如自噬［33］。自噬是一个通称，是所有细胞质物质被传递到动物细胞中的溶酶体或植物细胞和酵母细胞中液泡的途径。自噬通过溶酶体降解受损的蛋白质和细胞器，在维护蛋白质、线粒体的质量和细胞内稳态及机体发育、分化和组织重塑方面都起着重要作用［34］。自噬大致分为3类：大自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。自噬在几乎所有组织中都至关重要，细胞自噬具有多功能性，例如与肠道生物学、细胞发育和分化、细胞和组织重塑、骨微环境、肿瘤、抗衰老等［35］方面都有一定的关联。

GLICK等［36］认为，自噬的发生可分为以下几个步骤，包括起始、成核、伸长、成熟和降解。随着这些自噬体的形成，螯合产物的降解提供了氨基酸、核苷酸、糖和脂肪酸，用于维持整个组织甚至身体的稳定状态。在临床和流行病学上，衰老与KOA的关系已经得到证实。与衰老相关的危险因素，如组织和细胞再生能力有限、炎症介质表达增加、氧化应激等，引起软骨基质和细胞的损伤，促进KOA的发生和发展［37］。随着人体的衰老，细胞的基本自噬活性降低，清除效率下降，随后，各种大分子蛋白质的聚集增加，导致最终的细胞变性和功能缺陷，甚至凋亡。自噬和KOA的机制研究衰老与KOA之间的联系已经在临床和流行病学中得到证实［38］。当氧化应激发生时，自噬会被激活，受损的线粒体可以被清除，细胞内活性氧减少，保护软骨细胞免受KOA的负面影响，从而抑制软骨细胞凋亡［39］。自噬通过介导细胞凋亡和软骨细胞活性氧产生参与KOA的发生、发展［40］。当自噬被激活时，受损的线粒体可以被清除，细胞内软骨细胞活性氧减少，保护软骨细胞免受KOA的负面影响［38］。

4 小结与展望

ADSCs-Exos对于KOA是有效的，但仍存在不足。一是ADSCs-Exos因其所拥有的特性，导致在临床中的治疗具有广泛性，可运用于组织再生及修复重建等方面；但是，每一个作用机制的研究还不够深入，泛而不深。比如，介导免疫反应具体是哪一个因子？其机制认识仍不深刻。二是细胞自噬具有多功能性，与肠道生物学、细胞发育和分化、细胞和组织重塑、骨微环境、肿瘤、抗衰老等相关，同样也具有广泛性。三是通过查阅发现，微环境与疾病的发生、发展存在联系。因此，笔者认为，ADSCs-Exos是否可以改变KOA患者的微环境状态，从而起到治疗作用有待考究，可能会为临床治疗KOA提供新思路、新方法。

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收稿日期：2023-04-01；修回日期：2023-06-09

基金项目：甘肃省科技计划项目（22YF7FA104）；兰州市人才创新创业项目（2020-RC-55）

作者单位：1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730030；4.广河县妇幼保健院，甘肃 广河 731300

通信作者：赵军 甘肃省兰州市七里河区瓜州路418号，673078008@qq.com