亚硒酸钠对羊肚菌液体发酵的影响

杜孟祥, 戚姚瑛, 王子玉, 张杰杰, 孙玉军*

(1.安徽科技学院 农学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽科技学院 生命与健康科学学院,安徽 凤阳 233100)

羊肚菌(Morchellaesculenta)属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellac)、羊肚菌属(Morchella)[1]。羊肚菌营养物质极其丰富,具有很高的食用和药用价值。羊肚菌中含有大量的多糖和蛋白质等生物活性物质,研究表明所含有的多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节及降血脂等特性[2]。

微量元素是一类对维持机体正常生命活动及治疗和预防疾病具有重要意义的物质,但是机体自身不能合成,需要外源补充[3]。硒是人体必需微量元素,具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、抗炎症[6]等多种功能。在生物体中无机硒通过与多糖、多肽或蛋白质结合,转化而形成有机硒[7-8],在人体中主要以硒代氨基酸的形式存在[9]。研究表明,有机硒类化合物依布硒在体外抗病毒试验中,能显著抑制新冠病毒复制,在新冠病毒的临床治疗中具有一定潜力[10]。

野生羊肚菌资源有限,人工栽培环境条件苛刻,而现代液体发酵技术不仅成本低,还不受环境因素限制,羊肚菌发酵菌丝还具有产量高、质量稳定、周期短等特点[11]。食用菌具有很强的微量元素富集能力,易于将无机硒转化为有机硒[12],富集微量元素的食用菌在补充人体所需微量元素的同时,药理活性也有所提升。

本研究对不同来源的5株羊肚菌菌株的硒耐受能力进行比较,筛选具有较好耐受能力的菌株,进一步在添加不同浓度亚硒酸钠的液体培养基中,测定菌丝生长和菌丝中硒富集率等指标,探究羊肚菌液体发酵培养基中亚硒酸钠的最适添加量,为羊肚菌富硒液体发酵培养提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试剂

1.1.1 供试材料 5株野生羊肚菌由凤阳及周边地区采集分离获得,按采集时间分别编号为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5。

1.1.2 供试试剂 葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、Na2SeO3、2,3-二胺基萘、盐酸羟胺、乙二胺四乙酸二钠、考马斯亮蓝G-250、磷酸、浓硫酸、蒽酮、浓硝酸、高氯酸、环己烷、双氧水等均购于国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯。

1.2 仪器与设备

F-4600型荧光分光光度计(日本日立有限公司);FD-1A-50型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);GI80DS型高温高压蒸汽灭菌锅(致微仪器有限公司);KS-5200DE型液晶超声波清洗器(昆山洁力美超声仪器有限公司);XHF-DY型高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司);V-500型可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);DT5-4型离心机(北京时代北利离心机有限公司);SPH2102型温控台式摇床(上海世平实验设备有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基的配制 固体培养基:200 g马铃薯、20 g葡萄糖、20 g琼脂、1 000 mL蒸馏水。液体发酵培养基:20 g葡萄糖、5 g蛋白胨、3 g KH2PO4、1 g MgSO4·7H2O、1 000 mL蒸馏水。富硒培养基:称取0.5 g亚硒酸钠溶于100 mL超纯水中,配制成5 mg/mL亚硒酸钠母液,向培养基中添加母液,配制成亚硒酸钠终质量浓度分别为10、20、30、40、50 μg/mL的富硒固体和富硒液体发酵培养基。

1.3.2 菌种活化 将4 ℃下保存的羊肚菌母种接种到固体平板培养基中,26 ℃培养3 d,备用。

1.3.3 菌丝生长速度测定 用内径6.6 mm打孔器取活化好的羊肚菌菌块,接入富硒固体培养基中央,培养24 h,采用十字交叉法,用游标卡尺测量菌落直径(mm)。

1.3.4 羊肚菌富硒液体发酵培养 取10块0.5 cm2的固体培养物接入150 mL液体培养基中,26 ℃、170 r/min恒温培养5 d,使用高速分散器分散菌丝球,得羊肚菌种子液。种子液按10%接种量接入发酵培养基中,26 ℃、170 r/min恒温培养。

1.3.5 生物量测定 抽滤分离菌丝体和发酵液,菌丝体冷冻干燥,称重记录质量,计算生物量(g/L)。

1.3.6 羊肚菌菌丝胞内生物活性物质测定

1.3.6.1 胞内总蛋白含量测定 称取0.100 0 g富硒发酵培养的菌丝体粉末,加入5 mL蒸馏水重悬,超声破碎1 h(温度为60 ℃,功率为100 W)。12 000 r/min离心10 min,上清液即为蛋白提取液。采用考马斯亮蓝G-250法进行含量测定[13]。

1.3.6.2 胞内可溶性糖含量测定 富硒发酵培养的菌丝体粉末按料液比1∶40加入蒸馏水,90 ℃水浴浸提2 h。离心取上清液,采用蒽酮-硫酸法进行测定[14]。

1.3.6.3 胞内有机硒含量测定 取0.5 g富硒菌丝体粉末于消化管中,加入2 mL 30%过氧化氢、8 mL浓硝酸、2 mL高氯酸,消化过夜,加热蒸发后样液,用稀盐酸定容,采用2,3-二氨基萘荧光法测定硒含量[15]。富硒率计算公式如下:

其中,Xi为菌丝体硒含量(mg/g);mi为菌丝体生物量(g);MNa2SeO3为亚硒酸钠的相对分子质量;MSe为硒相对原子质量;Ci为亚硒酸钠质量浓度(mg/mL);V为发酵液体积(mL)。

1.3.7 统计分析 所有样品采用3个重复,结果用平均值和标准差表示。分别采用SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0对数据进行统计分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 不同羊肚菌菌株耐硒性能比较

图1为5株羊肚菌在不同浓度的亚硒酸钠固体培养基上培养72 h的菌落直径的比较。在亚硒酸钠质量浓度为0～50 μg/mL范围内的固体培养基上,Y2菌株的菌落直径最大,显著高于其他菌株(P<0.05),菌落直径由大到小依次为Y2、Y5、Y3、Y1、Y4。富硒固体培养过程中,亚硒酸钠质量浓度较低(≤20 μg/mL)时,对5株羊肚菌菌丝生长有轻微的促进作用(如Y2),或者没有影响(如Y4);当亚硒酸钠质量浓度较高(≥30 μg/mL)时,对5株羊肚菌菌丝生长均有抑制作用。

图1 亚硒酸钠质量浓度对羊肚菌固体培养菌丝生长的影响Fig.1 Effects of sodium selenite on mycelium growth of Morchella esculenta in solid culture

亚硒酸钠的浓度不仅影响菌丝的生长速度,对菌丝的健壮程度和菌落的形态也有影响,如图2和表1所示。亚硒酸钠质量浓度较低(≤20 μg/mL)时,菌丝长势较好,菌丝呈白色浓密状,生长速度相较于对照组略快。随着亚硒酸钠浓度增加,Y2菌丝生长受到抑制,颜色变红、菌落稀,密度较低。图2为菌株Y2在不同浓度富硒固体培养基中的菌落形态,其他菌株形态接近,未列出。比较以上5种菌株在富硒固体培养基上的菌落直径,可以看出羊肚菌Y2菌株耐硒能力最强,其在含有20 μg/mL亚硒酸钠的平板上,菌丝延伸速度最快,因此作为后续富硒发酵的菌株。

图2 亚硒酸钠对羊肚菌Y2菌株菌落形态的影响Fig.2 Effects of sodium selenite on colony morphology of Morchella esculenta Y2 strain

表1 亚硒酸钠对羊肚菌Y2菌株生长的影响

2.2 羊肚菌Y2菌株液体发酵生长曲线

在液体发酵条件下,羊肚菌Y2菌株菌丝体生物量随着液体发酵时间的增加呈增长趋势(图3)。培养1～2 d增长速率最快,之后由于培养基营养物质被大量消耗,生物量积累速度降低,但总量仍在增加,在培养5 d后获得最大生物量5.287 g/L。故羊肚菌Y2菌株富硒液体发酵时间选择5 d。

图3 羊肚菌Y2菌株生长曲线Fig.3 Growth curve of Morchella esculenta Y2 strain

2.3 亚硒酸钠浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体生物量的影响

在液体发酵培养基中添加不同浓度的亚硒酸钠,振荡培养5 d后,测定其生物量的积累,结果如图4所示。亚硒酸钠添加质量浓度≤20 μg/mL时,羊肚菌Y2菌株菌丝体生物量随着亚硒酸钠浓度的增加而略增加,未加硒时菌丝体生物量为5.276 g/L,亚硒酸钠质量浓度为20 μg/mL时,菌丝体生物量最大,为5.500 g/L,但差异不显著;亚硒酸钠质量浓度≥30 μg/mL后,菌丝体生物量呈下降趋势(图4)。

图4 亚硒酸钠质量浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝生物量的影响Fig.4 Effects of sodium selenite concentration on the mycelial biomass in liquid fermentation of Morchella esculenta Y2 strain

2.4 亚硒酸钠浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内总蛋白含量的影响

亚硒酸钠质量浓度在0～50 μg/mL范围内,羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内总蛋白含量随着亚硒酸钠添加量的增大而减小(图5)。未加硒组菌丝体胞内总蛋白含量为2.4 mg/g,亚硒酸钠质量浓度为10、20 μg/mL时,胞内总蛋白含量分别降到2.35和2.25 mg/g,比未加硒组分别降低2.08%和6.25%,表明液体发酵培养基中添加亚硒酸钠使羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内总蛋白合成减弱。当亚硒酸钠质量浓度在30、40、50 μg/mL时,蛋白质含量显著下降,分别比未加硒组下降16.67%、27.92%、32.5%。

图5 亚硒酸钠质量浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内总蛋白含量的影响Fig.5 Effects of sodium selenite concentration on the content of total protein in the mycelium of Morchella esculenta Y2 strain under liquid fermentation

2.5 亚硒酸钠浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内可溶性糖含量的影响

液体发酵培养基中亚硒酸钠质量浓度在0～50 μg/mL范围内会促进羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内可溶性糖的合成,可溶性糖含量随着亚硒酸钠添加量的增大出现先增加后减小的趋势(图6)。当亚硒酸钠质量浓度为20 μg/mL时,菌丝体可溶性糖含量达到最大值(161.6 mg/g),显著高于未加硒组的129.6 mg/g。

图6 亚硒酸钠质量浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内可溶性糖含量的影响Fig.6 Effects of sodium selenite concentration on intracellular soluble sugar content in the mycelium of Morchella esculenta Y2 strain under liquid fermentation

2.6 亚硒酸钠浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内有机硒富集率的影响

由表2可知,随着亚硒酸钠质量浓度的增大,羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内有机硒含量和富硒率都呈现先上升后下降的趋势,当液体发酵培养基中亚硒酸钠质量浓度为20 μg/mL时,其菌丝体硒含量和富硒率均为最大,分别可达0.180 mg/g和10.84%。综上,确定羊肚菌Y2菌株富硒液体发酵的最佳亚硒酸钠添加质量浓度为20 μg/mL。

表2 亚硒酸钠浓度对液体发酵羊肚菌Y2菌株菌丝体胞内有机硒富集率的影响

3 结论与讨论

羊肚菌液体发酵多用于液体制种、食品和医药研发等方面,液体菌种具有生产成本低、周期短、菌龄一致等优点;羊肚菌发酵产物现已开发为调味品、调味酱、保健饮品、保健酒、发酵醋和腐乳等多种功能性食品;羊肚菌发酵液和菌丝体均含有多种药用活性成分,可用于改善胃粘膜损伤和新型降血脂类药物的开发与研究[16]。羊肚菌本身具有较高的营养和经济价值,且对硒元素具有较强的富集和转化能力,将羊肚菌进行富硒发酵培养,得到的含硒活性物质可同时兼顾羊肚菌和硒的优点,在保健品开发和医药研发等方面具有巨大潜力,因此富硒羊肚菌有很大的市场前景[17-18]。

现阶段对于富硒羊肚菌的研究多集中在液体发酵培养阶段,且不同菌株和不同培养条件之间具有较大差异[19]。张跃非[20]在亚硒酸钠质量浓度为9 μg/mL时,液体发酵培养得到菌丝体富硒率为18.34%。冮洁等[21]报道,通过深层液体发酵培养,当培养基中亚硒酸钠添加质量浓度为10 mg/L时最终菌丝体中硒含量达0.13 mg/g,富硒率为9.10%,比培养条件优化前提高了50.41%。向戌莲等[22]通过优化富硒发酵培养条件,在硒质量添加质量浓度为25 μg/mL时,无机硒转化为有机硒的硒源利用率为1.85%。在本研究中通过富硒固体培养筛选出生长速度最快的羊肚菌Y2菌株,进行富硒发酵培养,亚硒酸钠添加质量浓度在20 μg/mL时菌丝体生物量为5.500 g/L、胞内总蛋白含量为2.25 mg/g、胞内可溶性糖含量为161.6 mg/g、胞内有机硒含量达到0.180 mg/g、富硒率为10.84%,综合考量,羊肚菌液体发酵添加亚硒酸钠质量浓度为20 μg/mL时富硒率达到最高,为羊肚菌富硒液体发酵亚硒酸钠最佳添加量。

综上,运用现代发酵技术对羊肚菌进行富硒液体发酵具有便捷高效、成本低廉等优点,所培养的菌丝体中易于人体吸收利用的有机硒含量丰富,且生物量和可溶性糖含量更高,将食药性和补硒相结合,为富硒羊肚菌保健和医药产品开发的进一步研究奠定了基础。