LncRNA在缺血性脑卒中血脑屏障损伤中的研究进展*

胡 云,周礼鑫,童 理,李鑫泰 综述,杨剑文 审校

(湖南师范大学附属第一医院/湖南省人民医院神经内三科,长沙 410000)

缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是脑血管疾病中最常见的类型,其发病机制复杂,与脑损伤后神经细胞的能量衰竭、细胞离子稳态丧失、酸中毒、细胞内钙水平升高、血脑屏障破坏、胶质细胞活化和白细胞浸润等有关[1]。2019年流行病学数据显示,缺血性脑卒中仍然是全球致死和致残的主要疾病之一[2]。血脑屏障是位于血液与神经细胞之间的一种特殊屏障结构,它是由脑毛细血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞及基底膜所组成的细胞联合体,能有效地阻止大多数化合物从血液到中枢神经系统的流入,所有这些单位共同保护神经环境的化学成分,以保持大脑功能正常。在发生脑缺血性事件后,随着血脑屏障通透性发生改变,脑缺血进一步进展,对于如何维持血脑屏障的完整性是治疗缺血性脑卒中的关键因素。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一类新的转录本,其长度超过200个核苷酸,在很长一段时间中被认为是基因组转录产生的“垃圾”,不具备任何生物学功能[3]。近10年来,随着基因二代测序技术的发展,LncRNA是否具有功能,一直存在着激烈的争论。至今,已发现25 191种LncRNA被收录在人类基因组中[4],它们通过参与基因的表达调控,可以从表观遗传调控,转录水平及转录后水平发挥作用[5]。本文总结了有关LncRNA在缺血性脑卒中血脑屏障损伤中的作用的相关研究进展,发现LncRNA对缺血性脑卒中血脑屏障具有一定的调节作用,通过保持血脑屏障完整性来达到治疗缺血性脑卒中的目的。

1 LncRNA对内皮细胞和血管生成的作用

内皮细胞是排列在毛细血管壁上的鳞状上皮细胞,存在于血管内层中,是血脑屏障中关键一环,与其他血管区域的细胞相比,脑微血管内皮细胞的表型具有特异性。它们具有腔内/腔外极化、紧密连接、连接黏附分子(JAMs)和限制极性物质的特定转运机制,这些特性有助于维持血脑屏障的稳定性[6]。血管生成可以重建或增强缺血区域脑血流,其特征是从现有的血管内皮细胞中长出新的血管,能够将血液和营养输送到脑受损区域。在缺血性脑卒中中,LncRNA可以通过直接或间接调控内皮细胞、血管生成,进而影响血脑屏障的通透性。

有研究显示,转移相关的肺腺癌转录物1(MALAT1)与缺血性脑卒中关系非常密切,是内皮细胞增生的潜在靶点。有学者发现在氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)诱导的原代小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd3细胞)损伤中,高表达LncRNA MALAT1,促进内皮细胞中血管内皮生长因子B(VEGFA)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(P-AKT)的表达,而抑制LncRNA MALAT1表达后,同样促进内皮细胞的增殖、迁移[7]。这一发现与既往体外研究结果相符,在沉默LncRNA MALATI1后,既促进了内皮细胞新生又促进了细胞迁移,有趣的是,在使用LncRNA MALAT1的模拟物后,内皮细胞新生则受到抑制[8]。WANG等[9]发现在培养的小鼠脑微血管内皮细胞中,敲除LncRNA MALAT1后,过表达的15-脂氧合酶-1(15-LOX1)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)蛋白表达下调,细胞增殖、迁移和CD31阳性细胞的数量减少,表明LncRNA MALAT1可能通过调节15-LOX1和STAT3的表达来促进血管生成。由此可知,LncRNA MALAT1可以调控内皮细胞及血管生成。

人类母系表达基因3(MEG3)最初被发现是一种肿瘤相关的LncRNA,在脑和内皮细胞中高表达[10-12]。ZHAN等[13]证实在氧糖剥夺/复氧(OGD/R)干预后的大鼠脑微血管内皮细胞模型中抑制MEG3可以促进血管生成,当选择性敲除MEG3后,NADPH氧化酶4(NOX4)和p53的表达减少,促血管生成因子[缺氧诱导因子(HIF-1)、VEGF]表达增多,细胞内活性氧生成减少,也可能是通过激活Notch或者Wnt/β-catenin信号通路来促进血管生成[14-15]。

LncRNA还可以和微RNA(miRNA)结合,抑制其与mRNA结合,间接调控血脑屏障中内皮细胞或者血管生成。比如前面所提及的LncRNA MALAT1,在缺血情况下,LncRNA MALAT1通过负调节miR-126 抑制PI3K/Akt信号通路,抑制内皮细胞增生[16]。人类母系表达基因8(MEG8)定位于14q32位点,目前已被证明在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中该基因可以诱导内皮细胞屏障损伤,减少总VE-钙黏蛋白[17],由此可知MEG8在内皮细胞中具有潜在作用。SUI等[18]证明miR-130a-5p模拟物可以降低脑微血管内皮细胞(BMECs)活力,在敲除MEG8后通过负调节miR-130a-5p来抑制BMECs的血管生成及VEGFA的表达,进而对缺血性脑卒中后的脑缺血起到保护作用。小核仁RNA宿主基因(SNHGs) 是一组LncRNA,最早在各类肿瘤中发现,可以诱导癌细胞的增殖、促进细胞周期进展、侵袭和转移[19]。研究表明SNHG1和SNHG12与内皮细胞及血管生成存在关联。ZHOU等[20]发现在OGD/R诱导的bEnd3细胞中敲除SNHG1后,内皮细胞增殖减少,促进OGD/R诱导的损伤,而在下调miR-298后细胞损伤逆转,证实SNHG1作为miR-298的分子海绵来保护脑微血管内皮细胞免受缺氧损伤。CAI等[21]在OGD/R条件下,发现SNHG12在小鼠原代BMECs中表达升高,并促进促血管生成因子VEGFA和碱性成纤维细胞生长因子(FGFb)的表达及毛细血管样管的形成,miR-199a模拟物的转染可以降低BMECs的活力,然而miR-199a+pcDNA-SNHG12的共转染逆转了miR-199a诱导的作用,增强了上述过程。结果显示,SNHG12可以抑制miR-199a调节BMEC及血管生成,改善BMECs 缺血性脑卒中的损伤。

脑内皮细胞功能障碍是脑缺血后血脑屏障通透性增加的主要原因,血脑屏障内皮细胞死亡被公认为缺血再灌注后脑出血的前兆[22],所以内皮细胞功能恢复及血管生成有助于抑制缺血或者出血改变。LncRNA MALAT1、MEG3、MEG8、SNHG1和SNHG12对内皮细胞及血管生成产生正性或负性调控,表明在脑缺血再灌注发生后LncRNA可以成为保护血脑屏障完整性的有效方法。

2 LncRNA对周细胞的作用

周细胞位于微血管周围,用突起包裹毛细血管,在中枢神经系统中大量表达,是组成血脑屏障的重要成分。在缺血损伤急性期,周细胞缺失可以导致血脑屏障损伤和脑水肿[23]。中枢神经系统周细胞突起可分为3种亚型:螺旋周细胞、网状周细胞及非典型形态的新型周细胞,均表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),不同的是表达水平有差异。α-SMA是周细胞的主要收缩蛋白,具有收缩性,可以改变毛细血管直径调节微循环血流[24-25]。在大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)中,zeste同源物2(EZH2)增强子和α-肌动蛋白共同定位于细胞质,能促进VSMCs细胞骨架的形成。EZH2通过LncRNA牛磺酸上调基因1(TUG1)与α-肌动蛋白耦联促进α-肌动蛋白甲基化和F-肌动蛋白聚合。而在敲除LncRNA TUG1后,EZH2与α-肌动蛋白的共定位减少,VSMCs的细胞骨架解聚,证实了LncRNA TUG1是细胞骨架形成所必需的[26]。有研究发现TUG1普遍存在于其他组织中,例如脑、肝、肺、肾和血管[27-30]。根据其标记物表达特点,周细胞中也可能存在TUG1,并且可能在调控血脑屏障中起着重要作用。但需要注意的是,周细胞大部分标记物不具有特异性,其特点使得周细胞难以与其他血管细胞区分,因此对于周细胞研究的准确性有待进一步探讨。目前LncRNA在周细胞中的研究甚少,周细胞在缺血性脑卒中发生后的病理生理机制仍需更深层次的研究,为缺血性脑卒中治疗提供有希望的靶标。

3 LncRNA对星形胶质细胞尾足的作用

星形胶质细胞参与神经血管单元(NVU)组成,其尾足是血脑屏障形成和脑内稳态的关键成分。缺血性脑损伤后,稳态丧失和渗透压的改变导致星形胶质细胞肿胀,血脑屏障完整性受到破坏。星形胶质细胞表达神经递质受体、离子通道和代谢物转运蛋白,对附近的神经元活动做出反应[31]。水通道蛋白-4(AQP4)在星形胶质细胞中表达,并介导水穿过血脑屏障,被认为是脑缺血后诱发细胞毒性水肿及血管源性水肿的关键因素[32-33]。有研究证实,以下LncRNA通过分子海绵miRNA影响AQP4调节诱导血脑屏障通透性。ZHANG等[34]证实了在MCAO/R小鼠模型中,沉默LncRNA SNHG14,AQP4的表达下调,可以减轻梗死体积增加和神经损伤,在OGD(BV2)干预模型中,阻断了OGD引起的炎症和氧化应激,在抑制miR-199b后发生逆转。

LncRNA MALAT1对星形胶质细胞(MA-C细胞)活力、细胞凋亡和细胞毒性具有重要影响。WANG等[35]通过建立MCAO小鼠模型,发现LncRNA MALAT1的表达明显上调,并可以靶向作用于miR-145增加AQP4的表达,使小鼠脑梗死体积增加,而在LncRNA MALAT1敲除后miR-145的水平明显上调,AQP4的表达下降。这表明,沉默LncRNA MALAT1可以通过miR-145表达调节AQP4,从而改善小鼠缺血性脑卒中的损伤。结果显示,SNHG14和LncRNA MALAT1可以靶向作用于相应的miRNA,对星形胶质细胞具有保护作用,这可能是脑卒中干预治疗的新型靶点。

综上所述,对于LncRNA在缺血性脑卒中血脑屏障调节作用的研究中,主要对内皮细胞、周细胞及星形胶质细胞单独进行了探讨。相对于内皮细胞来说,周细胞及星形胶质细胞研究较少。有证据发现星形胶质细胞可能通过与内皮细胞相互作用促进血脑屏障形成,Wnt/β-catenin信号通路是使内皮细胞获得血脑屏障特性的关键环节[36]。而最新研究发现星形胶质细胞能衍生Wnt生长因子,可能促进内皮细胞生成,保持血脑屏障的完整性[37]。依前文所述不难发现,LncRNA MALAT1对内皮细胞及星形胶质细胞均有调节作用。那么血脑屏障组成成分之间的相互作用,能否寻找到交叉或相同作用的靶基因,有助于发现新的药物靶标。此外,LncRNA作用机制的研究主要集中在相关的miRNAs上,LncRNA可以和miRNA结合,抑制其与mRNA结合,对mRNA的表达进行间接调控,靶向的miRNA可以通过生物信息技术提供更多有用的治疗靶标。

4 展 望

在缺血性脑卒中发生后引发的血脑屏障破坏是近年国内外研究的热点,其具体机制尚未阐明。防止血脑屏障破坏是脑卒中干预中的重要治疗策略。LncRNA参与基因的表达调控,在肿瘤、神经系统疾病等多种疾病中发挥作用,但在脑卒中后血脑屏障破坏中的具体功能仍然很大程度上未知。LncRNA作为生物标志物、治疗靶点和新的表观遗传干预工具,目前研究仍处于动物实验阶段。就当前而言,选择合适的LncRNA作为脑缺血诊断和预后标志物还为时尚早。首先阐明LncRNA的生物学功能是一个难点,目前对于LncRNA的作用机制研究不够深刻、全面,而且部分LncRNA缺乏特异性,可能引起一些未知的中枢神经系统不良反应;其次,由于技术上的限制,很难避免脱靶效应和基因座缺失效应,而脱靶效应和基因座缺失效应一旦发生,则是难以挽回的灾难;最后,由于血脑屏障的存在,靶向抑制脑内核糖核酸酶也是当前的一个挑战。LncRNA的研究在缺血性脑卒中中仍处于黄金时期,虽然动物实验阶段研究周期长,但相信在不久的将来,随着技术越来越成熟、科研成果不断更新,可以寻找到更多有助于改善脑卒中血脑屏障的靶点。