Bcl-2蛋白家族调控细胞凋亡机制及其在创面修复中的应用研究进展*

唐 婷,韦柳叶,黄金梅 综述,唐乾利 审校

(1.广西中医药大学研究生院,南宁 530000;2.右江民族医学院/桂西高发病防治重点实验室,广西百色 533000)

创面愈合是不利因素对机体造成的局部或大面积组织细胞损伤时出现的一种先天自适应性防御反应,由多种信号相关通路及相关蛋白、因子相互作用。其中内在和外在因素影响而愈合迟缓、中断或停滞的非癌性创面被国际伤口感染协会(International Wound Infection Institute,IWII)称为慢性创面。慢性难愈合创面具有病因复杂、并发症多、病程长、复发率高等特点[1-2]。近年来有研究发现,由基因控制的细胞自主有序的程序性死亡过程,即细胞凋亡,可及时清除体内多余的细胞及受损细胞,调节机体正常发育和生命活动,在创面愈合过程中起着关键作用[3],且细胞凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路交汇点,而该交汇点受B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白调节。另有学者研究指出,可通过调节Bcl-2家族蛋白中凋亡抑制因子与凋亡诱导因子的比例抑制细胞凋亡,从而达到促进创面愈合的目的。本文对Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中的调控机制及其在创面修复中的应用研究进展进行了综述,以期为Bcl-2家族蛋白在慢性难愈性创面治疗中的应用提供参考。

1 Bcl-2家族蛋白

1.1 Bcl-2家族蛋白概述

1984年,Bcl-2基因被首次在人类B细胞淋巴瘤的第14号和第18号染色体易位断裂点t(14,18)上分离获得[4],且研究发现染色体易位使14号染色体上免疫球蛋白重链基因与Bcl-2基因异常融合形成的并列式头尾结构可导致Bcl-2蛋白过度表达。1986年,有学者[5-6]成功克隆出Bcl-2转录的cDNA序列,并从其碱基序列中衍生出Aa序列。1988年,REED等[7]研究发现,Bcl-2基因具有潜在致癌性,并确认其是一种原癌基因。此后大量研究发现,Bcl-2基因的编码产物Bcl-2蛋白是细胞内完整的膜蛋白,具有抗凋亡特性,能够抑制线粒体活性氧产生,与细胞程序性死亡密切相关,为后续研究Bcl-2蛋白与线粒体相关的细胞程序性死亡奠定了基础[8]。另外,自Bcl-2被发现以来,又陆续发现了Bcl-xL、Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein gene,Bax)等与Bcl-2高度同源的其他分子,它们具有与Bcl-2相似的成孔细菌毒素结构域,且具有人工合成膜形成离子通道的能力,为Bcl-2的后续研究指明了新的方向[9-10]。

1.2 Bcl-2结构与分类

Bcl-2基因存在于线粒体外膜、内质网膜和核膜上,相对分子质量为26×103,全长约250 kb,由3个外显子和2个启动子组成,能够被染色体易位机制激活,可编码Bcl-2α和Bcl-2β两种蛋白,其中Bcl-2α是抗凋亡作用的主要蛋白,可由p53、激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、活化T细胞核内因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)和环腺苷酸应答元件(cAMP response element,CRE)等多种转录因子触发。

截至目前,已经发现27种Bcl-2家族同源蛋白,并根据结构和功能将其分为两类:一类是Bcl-2折叠蛋白,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、骨髓细胞白血病蛋白-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)、Bfl-1/A1、Bcl-B共6种抗凋亡蛋白及Bcl相关蛋白Bax、Bak、Bok共3种促凋亡蛋白;另一类是促凋亡“BH3-only”蛋白,包括Bim、Bad、Bmf、Bid、Bik、Noxa、Puma、Hrk等,仅含有促进细胞凋亡活性所必需的致死性结构域BH3基因序列[11-15]。

2 Bcl-2在细胞凋亡中的作用机制

细胞凋亡是一种复杂而精细的程序性细胞死亡过程,在胚胎发生、免疫、组织发育和内环境稳定维持等方面发挥着重要作用[16]。相关研究证实,细胞凋亡过度或凋亡过少等病理状态均可诱发慢性难愈合创面、癌症等的形成。Bcl-2作为与细胞凋亡最密切相关的基因,在多孔动物(海绵)、刺胞动物(海葵、珊瑚、水母)、扁壳动物及哺乳动物等多种多细胞动物中均有发现,可通过启动Bcl-2家族及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族相关凋亡因子的释放,以及与特定因子相互结合后控制线粒体外膜(mitochondrial outer membrane,MOM)的完整性而调控细胞凋亡过程[17-18]。

2.1 Bax/Bak的促凋亡作用

Bax和Bak是Bcl-2家族中发挥促细胞凋亡作用的主要蛋白,是调控线粒体细胞凋亡过程的重要组成部分[19]。正常情况下,Bax主要位于细胞质中,Bak主要位于线粒体膜上,当细胞接收到凋亡刺激后,细胞质中的Bax迁移并作用于MOM形成孔状通道,使激活Caspase家族的凋亡因子逃逸,进而诱导细胞凋亡。而Bak可直接在线粒体内与自身或Bax蛋白结合形成线粒体跨膜通道而诱导细胞凋亡。

2.2 Bcl-2蛋白的抗氧化作用

相关研究显示,Bcl-2蛋白过度表达和磷酸化均可减少氧自由基的产生和脂质氧化物的形成,进而抑制细胞的凋亡,其作用机制可能与细胞生长、增殖、DNA修复有关。CHANVORACHOTE等[20]的实验表明Bcl-2的抗氧化作用是间接的,即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧。细胞色素C作为呼吸链中重要的电子传递体,它从线粒体内膜上的释放会阻断电子向下游传递并危及呼吸链的功能,导致超氧阴离子的加速产生。而Bcl-2蛋白可以抑制细胞色素C的释放,从而通过抑制超氧阴离子的产生,进一步抑制细胞凋亡。此外,线粒体的巯基可能组成了细胞内氧化还原电位的传感器,Bcl-2可能通过抑制细胞内的谷胱甘肽(GSH)等抗氧化剂的外泄,促进谷胱甘肽进入细胞核内,降低细胞内的氧化还原电位,从而抑制细胞凋亡[21]。因此,Bcl-2蛋白的性质远非仅仅是一种抗氧化剂。

2.3 Bcl-2、Bcl-X1和Bax的协同抗凋亡作用

Bcl-2家族蛋白在促进细胞生长和生存方面发挥着关键作用,凋亡的内在途径主要是通过阻断Bcl-2家族促凋亡蛋白,从而抑制细胞凋亡[22]。Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bcl-X1和Bax相互作用,在线粒体上形成离子通道并降低线粒体膜通透性(mitochondrial membrane permeabiliti,MMP),进而影响巨孔的形成。同时,细胞色素C从线粒体内膜上释放,激活Caspase-9,随后细胞色素C和凋亡诱导因子(Apaf-1)结合并激活Caspase-3,而活化的Caspases-3降解底物后,其蛋白降解产物又引起线粒体通透性改变,抑制线粒体释放促凋亡蛋白,并最终导致细胞凋亡发生[23-24]。

2.4 BH4结构域维持细胞内钙离子稳定

Bcl-2蛋白的BH4结构域主要是作为控制细胞内Ca2+信号的关键决定因素出现的,可特异性靶向作用于1,4,5-三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-trisphosphate receptors,IP3Rs)和ryanodine受体(ryanodine receptors,RyRs)等多个细胞内Ca2+转运通道,促使Ca2+从内质网腔内释放至细胞基质,并介导Ca2+通过线粒体外膜进入线粒体的电压依赖性阴离子通道[25](voltage-dependent anion channels,VDACs)而维持线粒体内钙离子稳定,阻止线粒体膜电位下降和线粒体通透性转换孔开放,从而抑制细胞凋亡;亦或与膜糖蛋白复合物结合,形成内质网上的膜钙通道,进而抑制钙介导的凋亡起始阶段[26-27]。

3 Bcl-2在创面修复中的作用

近年来,关于创面修复的细胞凋亡机制成为创面修复领域的研究热点之一,细胞的增殖和凋亡参与调控创面愈合过程中的多个环节而影响其预后。细胞凋亡是一种重要的生物学现象,就创面修复而言,一般经历炎症期、肉芽组织形成期和上皮化的过程。组织损伤与修复的整个过程均有细胞凋亡机制参与,特别是上皮细胞与成纤维细胞在组织修复中增殖与凋亡之间的平衡决定和影响着创面修复的进程、结局和预后。细胞凋亡分为三个基本时相,即启动(诱导)相、效应(调控)相、清除(降解)相。启动相接受体内外死亡信号指令如加热、辐射、毒素、肿瘤坏死因子等,经过凋亡信号转导途径(Bcl-2途径)到达效应相。效应相时众多促凋亡和抗凋亡基因相互制约处于动态平衡中,一旦进入清除相,Bcl-2激活Caspase-3,进而激活核酸内酶,激活的DNA酶游离出来使DNA降解,导致细胞凋亡[28-29]。

关于创面愈合过程中细胞凋亡时的形态学及生化变化受Bcl-2家族调控的研究较多。郑敏等[30]的研究显示,糖尿病足创面的发生及发展可能与Bcl-2水平降低及Bax水平升高造成的组织细胞凋亡率上升有关;李金凤等[31]通过建立大鼠烧伤创面模型观察油桐花水提物对烧伤创面Bcl-2、Bax表达水平的影响发现,油桐花水提物可通过提高抗凋亡因子Bcl-2水平、降低促凋亡因子Bax水平而抑制细胞凋亡的发生,进而促进烧伤创面愈合;曾娟妮等[32]的研究发现,美洲大蠊提取液可通过提高Bcl-2水平、降低Bax及Caspase-3水平而调控透明质酸和蛋白聚糖的表达,促进慢性难愈合创面的愈合。这些研究表明促进创面修复的机制可能是通过调节Bcl-2、Bax比例来调控细胞凋亡。

YAN等[33]的研究发现,片仔癀可降低糖尿病溃疡小鼠创面组织中活性氧自由基水平,促使ROS/Bcl-2/Bax/Caspase-3通路失活而减少表皮成纤维细胞凋亡,进一步验证了Bcl-2蛋白过度表达可降低氧自由基的产生,进而抑制细胞的凋亡,促进创面愈合。DING等[34]的研究显示,经Bcl-2修饰的脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)可上调Bcl-2及旁分泌因子水平,通过含孔支架迁移提高细胞存活率,延缓ADSCs凋亡,进而促进糖尿病小鼠创面愈合。总体而言,Bcl-2-ADSCs-scaffold可以有效加快愈合过程,促进创面植入后的新生血管形成,缩短创面愈合时间。

4 小结与展望

随着Bcl-2家族蛋白研究的不断深入,越来越多的学者研究发现Bcl-2家族蛋白可通过Bax/Bak发挥促凋亡作用、抗氧化作用、协同促凋亡作用、维持细胞钙离子稳定等参与细胞凋亡的调节,在创面修复和再生的不同阶段发挥作用。但迄今为止有关Bcl-2/Caspase信号通路促进创面愈合的应用研究多停留在动物实验层面,在人体中的应用研究较少。

创面再生在再生医学中的应用一直是一个迫切需要解决的问题,人们为此投入了大量的精力和时间。在各种基因中过表达Bcl-2可以促进细胞生存,诱导各种创面再生过程。同时,Bcl-2信号通路的激活可诱导多个信号通路发生相应的变化,进而参与创面愈合的整个过程,这是Bcl-2多效性效应的基础。鉴于Bcl-2在创面修复和再生的不同阶段发挥着不同的作用,对创面修复的研究可能会集中抑制Bcl-2信号转导,未来的治疗有望在创面修复给予Bcl-2抑制剂,加速创面愈合进程,减轻患者疼痛。进一步研究Bcl-2可能是更容易实现创面再生的重要途径,研发促进Bcl-2生成剂的药物应用于创面修复,未来也是一种无限可能。

综上所述,Bcl-2在创面修复中体现的作用,不仅仅是通过升高Bcl-2的浓度,降低Bax水平,还可以通过各种外部因素刺激其活性,抑制下联反应,促进创面修复。目前大量研究比较散在,没有形成网络整体性研究,要么是终点研究,未见时效关系,对于创面更是如此,因此探索以Bcl-2为基点的具有网络整体及时效性的研究可能是未来研究方向。