苦参总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及相关机制

许 诺,魏 玮,吴勤研

(1.东部战区总医院秦淮医疗区,江苏 南京 210002;2.东部战区总医院,江苏 南京 210016)

缺血性脑卒中是老年人群的高发病和常见死亡原因,且发病机制仍未完全阐明[1].有研究[2]认为,缺血性脑卒中的发病与血栓形成有关,由于流向脑组织的血流不足造成局部缺血、缺氧,血脑屏障通透性被破坏,引发脑组织水肿和缺血性坏死.目前,临床对缺血性脑卒中的治疗仍缺少特效方法,溶栓、拉栓、取栓等是常用的治疗手段,能够快速、有效地减轻脑损伤,但会受到治疗时间窗、治疗后血流再灌注等因素影响,容易引发脑出血等并发症,使患者病情进一步恶化[3],减轻脑缺血再灌注损伤是改善患者预后的关键.有报道[4]显示,黄酮类化合物对缺血性脑卒中有活血化瘀作用,还能够改善脑卒中后抑郁模型大鼠行为学,但对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究仍十分少见.本研究主要探讨苦参总黄酮对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及相关机制.

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂

健康成年雄性SD大鼠(南京市玄武区西普尔必凯生物技术中心,许可证号:X06171954),7周龄,体质量(200±10)g;饲养温度(23±2)℃,每日12 h光照模拟昼夜节律,自由进食、进水.

苦参总黄酮(批号KS56300,南京普怡生物科技有限公司,质量分数≥98%);白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒(上海美轩生物科技有限公司);反转录试剂盒、PCR试剂盒(科培瑞(上海)生物科技有限公司);兔抗人无翅型MMTV整合位点家族成员3a(Wnt3a)单克隆抗体、鼠抗人丝氨酸/苏氨酸激酶(GSK-3β)单克隆抗体、鼠抗人β-连环蛋白肽(β-catenin)单克隆抗体、鼠抗人G1/S-特异性周期蛋白-D1(CyclinD1)单克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体及相对应的二抗(北京艾柏森生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 造模与分组

应用大脑中动脉栓塞法构建大鼠局灶性脑缺血再灌注模型.使用1%戊巴比妥钠全麻大鼠,剂量为40 mg/kg,在左侧颈部正中切口处暴露颈总动脉,并分离颈内、外动脉,结扎颈外动脉远心端,夹闭颈总动脉、颈内动脉,经残端插入尼龙线,直至产生阻力后停止插入,结扎尼龙线栓切口下方,松开动脉夹.术后记录缺血开始时间,2 h后拔出线栓,缝合伤口.将最终造模成功的40只大鼠随机分为模型组、50 mg/kg苦参总黄酮组、100 mg/kg苦参总黄酮组、200 mg/kg苦参总黄酮组,每组10只.另取10只大鼠为对照组,手术步骤同模型组,但不插入尼龙线阻断血流.对照组和模型组给予生理盐水灌胃,苦参总黄酮组造模后给予相对应剂量的苦参总黄酮灌胃,7 d后取材.

1.2.2 神经功能评分和脑含水量、梗死体积检测

分别于缺血再灌注1、3、7 d使用改良的Longa评分系统进行神经功能评分,1～3分提示造模成功.腹主动脉取血后处死大鼠,每组随机选取5只大鼠取脑,用滤纸擦净表面血迹并称重,记录为脑湿质量,之后放入烘箱中烘干,再次称重为脑干质量,计算脑含水量:脑含水量=(脑湿质量-脑干质量)/脑湿质量×100%.每组取另外5只大鼠脑组织,-80 ℃下冷冻后均匀切片,将脑切片放于TTC染色液(2%)中避光染色30 min,温度控制在37 ℃,显微镜下观察白色缺血区域为梗死区、红色区域为非梗死区,计算脑梗死体积:脑梗死体积比=白色缺血区域总面积/切片总面积×100%.

1.2.3 血清IL-1、IL-6、TNF-α含量检测

取各组大鼠的腹主动脉血,室温放置20～30 min,4 000 r/min离心10 min,收集血清;应用酶联免疫吸附法测定血清白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量.

1.2.4 RT-PCR检测Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 mRNA表达

取大鼠脑组织标本,使用Trizol试剂盒提取总RNA,使用便携式组织匀浆机将脑组织打碎后离心,收集沉淀.测定总RNA纯度后行实时PCR反应合成cDNA.Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1及内参β-actin引物序列设计、合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成.Wnt3a正向引物:5′-ATACGTACGTAAGTACCGA-3′,反向引物:5′-CGTAGATCCGTACTAGCAA-3′;GSK-3β正向引物:5′-ATCAAT CGAATCGATGCTCA-3′,反向引物:5′-AACGTAGC TAGTAATCGATC-3′;β-catenin正向引物:5′-CTCGATCGATCGTAGCTAGCGTA-3′,反向引物:5′-AA GATCGATGCGATCGAGATCGC-3′;CyclinD1正向引物:5′-ATCGATCGAATCGAC TGCA-3′,反向引物:5′-AATCGATGCAGTGCATGCA-3′;β-actin正向引物:5′-CGCATTGATGAATCGATGCA-3′,反向引物:5′-AA GATCGTAGTCGACTAG AC-3′.反应体系共30 μL,反应设定条件:94 ℃预变性10 min,94 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,共35个循环,72 ℃延伸10 s.应用2-ΔΔCt计算Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 mRNA表达水平.

1.2.5 Western blot检测Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 蛋白表达

应用RIPA细胞裂解液提取大鼠脑组织标本的总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,行10%SDS-PAGE电泳,电转法将目标蛋白转膜,使用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭1 h,滴加兔抗人Wnt3a单克隆抗体(1∶500稀释)、鼠抗人GSK-3β单克隆抗体(1∶300稀释)、鼠抗人β-catenin单克隆抗体(1∶1 000稀释)、鼠抗人CyclinD1单克隆抗体(1∶500稀释)、兔抗人β-actin单克隆抗体(1∶2 000稀释),4 ℃孵培育过夜;次日滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,1∶4 000稀释,室温下1 h,ECL显影;使用Image J软件读取各条带的灰度值.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分

本研究结果显示,模型组大鼠神经功能缺损评分明显高于对照组(P<0.01);缺血再灌注时间1、3、7 d时不同剂量苦参总黄酮组大鼠神经功能缺损评分均明显低于模型组,随着苦参总黄酮剂量的增加大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0.05);随着缺血再灌注时间的增加大鼠神经功能缺损评分逐渐升高,苦参总黄酮组大鼠经功能缺损评分逐渐降低(P<0.05).见表1.

表1 各组大鼠神经功能缺损评分

2.2 各组大鼠脑含水量及梗死体积

本研究结果显示,模型组大鼠脑含水量、梗死体积明显高于对照组(P<0.01);不同剂量苦参总黄酮组大鼠脑含水量、梗死体积明显低于模型组,随着苦参总黄酮剂量的增加大鼠脑含水量、梗死体积明显降低(P<0.05).见表2.

表2 各组大鼠脑含水量及梗死体积

2.3 各组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量

本研究结果显示,血清IL-1、IL-6、TNF-α含量在各组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01).其中模型组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量明显高于对照组(P<0.01),不同剂量的苦参总黄酮组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均明显低于模型组(P<0.05);随着苦参总黄酮剂量的增加,大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量逐渐降低(P<0.05).见表3.

表3 各组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量

2.4 各组大鼠Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 mRNA表达水平

本研究结果显示,Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 mRNA相对表达量在各组大鼠间比较差异均具有统计学意义(P<0.01).其中模型组大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相对表达量明显高于对照组,GSK-3β mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.01);不同浓度的苦参总黄酮组大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相对表达量均明显低于模型组,GSK-3β mRNA相对表达量明显高于模型组(P<0.05);随着苦参总黄酮浓度的增加大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA相对表达量逐渐降低,GSK-3β mRNA相对表达量逐渐升高(P<0.05).见图1、表4.

1.对照组;2.模型组;3.50 mg/kg苦参总黄酮组;4.100 mg/kg苦参总黄酮组;5.200 mg/kg苦参总黄酮组.

表4 各组大鼠Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 mRNA表达水平

2.5 各组大鼠Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白表达水平比较

本研究结果显示,Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量在各组大鼠间比较差异均具有统计学意义(P<0.01).其中模型组大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量明显高于对照组,GSK-3β蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.01);不同浓度的苦参总黄酮组大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1 蛋白相对表达量均明显低于模型组,GSK-3β蛋白相对表达量明显高于模型组(P<0.05);随着苦参总黄酮浓度的增加大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1蛋白相对表达量逐渐降低,GSK-3β蛋白相对表达量逐渐升高(P<0.05).

见图2、表5.

1.对照组;2.模型组;3.50 mg/kg苦参总黄酮组;4.100 mg/kg苦参总黄酮组;5.200 mg/kg苦参总黄酮组.

表5 各组大鼠Wnt3a、GSK-3β、β-catenin、CyclinD1蛋白表达水平

3 讨 论

中医理论[5]认为,气血失衡是缺血性脑卒中基本病机,气虚血瘀致经脉不通,血流难以到达脑部,出现缺血性脑损伤,治疗应以益气化痰通络为主.有研究[6]显示,苦参总黄酮与化学药物单成分相比具有多成分、多靶点的特点,作用方式更复杂,可用于缺血性脑卒中不同阶段的治疗.筛选出缺血性脑卒中治疗中的不同作用靶点是现代中医药发展的主要方向.苦参总黄酮是由芦丁、槲皮素、葛根素等黄酮类化合物组成.芦丁能够降低炎症反应,缓解缺血再灌注损伤[7].槲皮素具有抗氧化、抗炎活性,可通过提高脑源性神经营养因子水平促进受损神经细胞修复[8].葛根素具有稳定血压、血脂、益智健脑、抗氧化等功效,能够清除自由基,缓解氧化应激所致的神经细胞损伤,治疗神经系统退行性病变[9].近年来的研究[10]发现,银杏总黄酮可抑制自由基和脂质过氧化,降低一氧化碳的分泌水平,改善脑循环,缓解缺血性脑卒中症状.但苦参总黄酮在缺血性脑卒中病情发展中作用及相关机制的研究仍十分少见.

炎症反应参与缺血再灌注损伤的发生与发展,能够大量分泌白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞毒性物质,加重神经元损伤[11].相关研究[12]显示,IL-1参与脑出血神经元损伤过程,随着IL-1表达水平的升高神经元损伤程度逐渐加重.人体正常水平的IL-6能够促进神经元修复,但过量的IL-6会加剧内皮细胞、神经元损伤[13].TNF-α在大鼠不同时限脑缺血再灌注损伤中发挥作用,随着缺血时间延长其表达逐渐增加,发挥损伤性生物学效应[14].本研究结果显示,缺血再灌注时间1、3、7 d时不同剂量苦参总黄酮组大鼠神经功能缺损评分均明显低于模型组,且随着苦参总黄酮剂量的增加大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0.05).不同剂量苦参总黄酮组大鼠脑含水量、梗死体积明显低于模型组,随着苦参总黄酮剂量的增加大鼠脑含水量、梗死体积明显降低(P<0.05).说明苦参总黄酮能够有效改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,降低脑含水量和梗死体积,有利于病情恢复.不同剂量的苦参总黄酮组大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量均明显低于模型组,随着苦参总黄酮浓度的增加大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α浓度逐渐降低(P<0.05).说明苦参总黄酮能够通过抑制炎症介质对抗缺血性脑卒中再灌注损伤的发生与发展.

相关研究[15]显示,细胞增殖、分化、凋亡在缺血再灌注损伤中发挥重要作用,Wnt/β-catenin信号通路参与细胞的增殖、分化,与缺血再灌注损伤密切相关.Wnt属于脂化修饰糖蛋白家族,Wnt3a能促进细胞分裂、加速增殖与分化,作为激活剂存在于Wnt/β-catenin信号通路[16].β-catenin是一种能够调节细胞增殖、分化的细胞骨架蛋白.GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路上游的关键酶,可通过影响β-catenin磷酸化保持其在细胞中低表达[17].CyclinD1是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因,参与调控细胞周期增殖信号[18].当无Wnt蛋白时,GSK-3β能够促使β-catenin在轴蛋白中磷酸化,被蛋白酶降解;当存在Wnt蛋白时,与相应受体结合后激活Wnt/β-catenin信号通路,GSK-3β磷酸化后会失去活性,阻断了β-catenin降解途径,导致细胞浆中β-catenin累积进入细胞核,激活CyclinD1,进而促进细胞增殖与分化[19].本研究中不同浓度的苦参总黄酮组大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA和蛋白相对表达量均明显低于模型组,GSK-3β mRNA和蛋白相对表达量明显高于模型组(P<0.05);随着苦参总黄酮浓度的增加,大鼠Wnt3a、β-catenin、CyclinD1 mRNA和蛋白相对表达量逐渐降低,GSK-3β mRNA和蛋白相对表达量逐渐升高(P<0.05).提示苦参总黄酮可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进缺血性脑卒中大鼠脑组织细胞存活,以减轻缺血再灌注所致的脑损伤.

综上所述,苦参总黄酮可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进缺血性脑卒中大鼠脑组织细胞存活,以减轻缺血再灌注所致的脑损伤;苦参总黄酮还能够通过抑制炎症介质对抗缺血再灌注损伤.在后续研究中,将进一步探讨苦参总黄酮中的单体成分对脑缺血再灌注损伤的保护作用,并为新药研发提供理论依据.