间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响

钟军，周慕邱，戴彬，吴文成，何轶*

间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响

钟军1，周慕邱1，戴彬2，吴文成1，何轶2*

1 湖南农业大学农学院，湖南长沙 410128；2 贵州省烤烟公司毕节市公司，贵州毕节 551700

【目的】探究利用烤烟与小葱、苦苣和油麦菜三种植物间作缓解其连作障碍，为消除烟田土壤连作障碍提供参考。【方法】采用16S RNA高通量测序技术对间作烤烟烟株根际土壤（连作烤烟烟株根际土壤为对照）细菌群落结构组成进行测定分析；利用Tax4Fun功能预测获得相应样品细菌群落的生态功能。【结果】间作处理的烟株根际土壤细菌群落的OTU数、丰度和多样性均大于对照，与CK处理相比，小葱（T1处理）、苦苣（T2处理）和油麦菜（T3处理）间作处理的丰度分别增加了16.52%、12.10%、6.28%，而OTU总数分别增加了6.00%、0.65%、3.49%；在门水平上的6个优势菌群中，与CK的丰度相比，T1、T2、T3处理在变形菌门上分别提高了42.86%、17.85%和21.43%，厚壁菌门上分别提高了27.27%、0%和9.09%，酸杆菌门上分别提高了9.09%、27.27%和36.36%，放线菌门上T2处理提高了7.14%而T1和T3处理分别下降了28.57%和14.30%，拟杆菌门上T1处理提高了8.33%而T2和T3处理分别下降了16.67%和8.33%，芽单胞菌门上T1和T3处理分别下降了50%和16.67%；在有显著差异的5个二级功能层上，与CK的丰度相比，T1、T2、T3处理在细胞膜运输功能上分别提高了96.54%、88.96%和92.68%，在复制与修复功能上分别提高了26.93%、25.04%和23.81%，在翻译功能上分别提高了24.99%、27.76%和26.64%，在碳水化合物代谢功能上分别提高了13.79%、23.75%和20.12%，在氨基酸代谢功能上分别提高了28.85、32.21%和34.21%。【结论】间作显著提高了烟株根际细菌群落的丰富度和多样性、改变了土壤微生物种群结构、提升了整体代谢能力和遗传信息处理能力。

烤烟；间作；根际土壤；细菌群落；结构；功能

土壤微生物作为农业生态系统中重要的组成部分，可产生各种有机酸、激素、抗生素和维生素等多种产物，对维持生态系统平衡起重要作用[1-3]；土壤微生物的种类、数目及群落结构不仅直接影响养分的转化与组成，也是维持和恢复土壤生产力的主要因素之一。土壤细菌是生态系统中微生物区系的主要组成成分，微生物区系的演变（数量和组成结构）是反映土壤环境质量变化的重要生物指标[4-5]。

有研究表明，利用植物与微生物互作可以提高资源利用、减少农药和化肥的投入，是农业绿色发展的重要内容之一[6]；而在间作、套作和轮作模式中植物可通过直接或间接作用来改善土壤环境，促进植物充分利用水分和养分、抑制杂草滋生和控制病虫害等[7]。研究表明，烤烟根际微生态环境失衡特别是土壤细菌群落结构的变化是引起其连作障碍的主要生物因 素[8-9]；在烤烟连作种植模式中，相同的烟株根系分泌物可能会导致土壤微生物群落结构变得更简单，从而影响土壤理化和生物活性，最终造成烟田土壤质量下降、烟株生长发育受阻、烟叶产量和品质降低、烟株病原体数量增加和土传性病害加重[10-14]；而采取间套轮作种植模式有利于构建良好的烟田土壤微生态系统，能在一定程度上调控土壤有益微生物种群结构，从而减轻烤烟的连作障碍[15-16]；葱属作物中挥发物以及浸提液中抑菌活性成分复杂[17]，常用来与其他植物进行间作[18]或轮作[19]以有效缓解连作障碍；苦苣植物根系分泌的黄酮类化合物具有很强的抗氧化活性[20]；植物对土传病害的抗性与根际土壤微生物关系密切，油麦菜的水提液抑制香蕉土壤中病菌数量的效果强于拮抗菌，且改善了香蕉土壤微生物的生态平衡[21]。而高通测序技术的发展，可同时对多种微生物基因组进行测序，相较于传统的分离培养方法有助于更好地深入研究微生物与作物生长发育之间的关系，为克服连作障碍提供数据支撑[22-23]。

以往对克服烤烟连作障碍的研究主要集中在套作和轮作种植[24-25]，对间作种植的研究也主要集中在防治病害上，但对间作条件下的烤烟根际土壤微生物环境的研究较少。为此，本研究以贵州毕节威宁县连作烟田为对照，研究小葱、苦苣、油麦菜与烤烟间作烟田对烟株根际土壤细菌群落组成及功能的影响，以期为连作障碍的生态调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验于2022年4—10月在贵州省毕节市威宁县（103°80′E，27°20′N）进行，该地属亚热带湿润季风性气候，平均海拔2200 m，年平均降雨量在909 mm左右，年日照时数1812 h，无霜期180ｄ左右。

试验地为连作烟田，每年两季，烤烟种植之后栽种紫花苕，第二年再种植烤烟，土壤为粘性土，pH 5.8、有机质含量27.77 g·kg-1、全氮含量2.28 g·kg-1、速效磷含量20.63 mg·kg-1、速效钾含量215.66 mg·kg-1。

供试烤烟品种云烟87为当地主栽品种，种植密度为16500 株/hm2。

1.2 试验设计和取样方法

以烟田间作小葱（T1）、苦苣（T2）、油麦菜（T3）为处理，不间作的烟田（CK）为对照，共4个处理，小区面积66.7 m2；2022年4月27日进行烟株移栽，5月10日分别将间作植物种植于烤烟的两侧（其中小葱、苦苣和油麦菜播种量分别为82500株/hm2、33000株/hm2和16500株/hm2，行距同烟株的行距1.2 m，株距为距烟株20 cm），于6月30日采集烟株根际土壤样品，重复3次。

根际土壤取样方法：铲去烟株周围表层3 cm深的土壤，用铁铲在距烟株茎秆约25 cm处进行深挖，烟株根际露出后，采用抖土法将根系抖落的土混合挑去烟株细根后作为根际土壤样品，重复3次，自封袋单独收集土壤样本并暂存于装有冰袋的聚乙烯箱中，再通过2 mm的土壤筛完全均化，最后储存在-80℃冰箱、备用。

1.3 土壤总DNA提取与测序

土壤总DNA提取和高通量测序等由北京诺禾生物科技有限公司完成测定。

1.4 数据分析

根际土壤细菌种群相对丰度等用 SPSS 16.0 软件进行One-Way- ANOVA单因素方差分析，利用QIIME软件计算Alpha多样性指数，利用R语言工具制作稀释曲线和土壤细菌群落的组成，通过最大似然法构建系统发生进化树以了解根际土壤细菌的进化关系，利用Circos软件制作Circos图分析土壤优势物种组成比例及其在样本中的分布比例，利用LEfSe软件分析土壤产生显著性差异影响的群落，利用R语言中PCoA分析土壤的菌群结构差异，利用Tax4Fun方法将现有的16S rRNA基因测序数据与SILVA数据库对比以比较功能基因在生物代谢通路上的丰度差异，采用SPSS 16.0统计软件对试验数据进行处理，采用独立样本检验分析在≤0.05水平上的样本间显著性差异[18]。

2 结果与分析

2.1 根际土壤细菌特征分析

2.1.1 丰度和多样性

由图1可知，烟田烟株根际土壤细菌丰度的变化随间作植物的不同存在差异，其大小排列为T1>T3>T2>CK，且T1（间作小葱）处理显著高于T2（间作苦苣）和T3（间作油麦菜）处理，与CK 相比，T1、T2和T3处理烟株根际土壤细菌的丰度分别增加了16.52%、12.10%和6.28%。说明烟株根际土壤细菌丰度，间作处理的均显著高于连作烟田（CK）；此外，T1处理烟株根际土壤细菌的丰度比T2和T3处理的分别增加了3.95%和9.64%，说明在烤烟不同的间作植物中，以间作小葱的细菌丰度最高。

基于门分类水平对各个处理土壤细菌群落的Alpha多样性结果表明（图1），与连作烟田根际土壤细菌（CK）相比，3种间作处理的Shannon、Ace、Chao 多样性指数均高于对照，其中，T1、T2和T3处理在Shannon和Chao指数上的差异不显著，而T1处理（3860）与T2（3757）处理在Ace指数上的差异达显著水平但两者与T3处理（3812）间的差异均不显著。由此可见，间作处理的烟株根际土壤细菌群落的多样性和均匀度均高于对照。

图1 烤烟连作和间作条件下烟株根际土壤细菌丰度和多样性

2.1.2 OTUs的维恩图

稀释性曲线显示（图2A），当细菌测序量达到10000时，曲线逐渐趋于平缓，结合基于门分类水平的各样本文库的覆盖度均在 98.8%以上，说明基于本试验的测序深度，土壤中包括的稀有物种在内的所有细菌均分布均匀且已得到分析，比较真实地反映了细菌群落组成。

OTU分析表明（图2B），CK、T1、T2、T3四个处理分别含有细菌OTUs为4463个、4731个、4492个、4619个；4个处理共有细菌OTUs为2383个，分别占各自OTUs的53.40%、50.37%、53.05%、51.59%；4个处理各自特有的细菌OTU分别为498个、852个、508个和644个，分别占各自OTUs的11.16%、18.01%、11.31%、13.42%。这些数据表明，各个处理OTU组成存在差异，间作根际土壤不仅OTU数目多，还存在更多特有的OTU。

图2 烤烟连作和间作条件下根际土壤OTUs的维恩图

2.2 土壤细菌群落组成

2.2.1 细菌群落结构组成

由图3A可知，从门水平到种水平，与烟株间作的不同植物类型对根际土壤细菌群落结构有不同的影响。此外，各个处理根际土壤之间细菌进化关系的结果显示（图3B）：进化关系比较近的细菌群落主要有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacte- riota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、芽单胞菌纲门（Gemmatimonadetes）、绿湾菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota）、疣微菌门（Verrucomicr- obiota）、厚壁菌门（Firmicutes）、未明确细菌（unidentified_Bacteroidota）、硝化螺旋菌门（Nitrospi- rota）、泉古菌门（Crenarchaeota）、蛭弧菌门（Bdellovibrionota）、蓝细菌门（Cyanobacteriota）、粘菌门（Myxococcota）、装甲菌门（Armatimonadota）等15个门。

图3 烤烟连作和间作条件下根际土壤细菌群落结构组成差异

虽然在门水平上相对丰度＞3%的细菌均相同，分别是变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门，为根际土壤的主要细菌类群，高于其他优势菌群，约占总菌群的86.73%（图4A）；但Circos图却反映出优势菌在不同处理中的分布比例和各个处理优势菌的组成均有所差异（图4B）。

图4 烤烟连作和间作条件下根际土壤细菌的群落组成

2.2.2 优势菌种组成及其在样本中的分布比例

图5从里圈到外圈依次展示各个处理土壤根际优势菌的门、纲、目、科、属水平的物种组成，变形菌门包括Alphaproteobacteria纲和Gammaproteobacteria纲、Sphingomonadales目和Xanthomonadales目、Sphi- ngomonadaceae科和Rhodanobacteraceae科、属和属，芽单胞菌门包括Gemmati- monadetes纲、Gemmatimonadales目、Gemmatimonad- aceae科、属，酸杆菌门包括Acidobact- eriae纲、Bryobacterale目和 Solibacterales目、Bryobac- teraceae科和Solibacteraceae科、属和属，拟杆菌门包括Bacteroidia纲、Chitinophagales目、Chitinophagaceae科、属，放线菌门包括Thermoleophilia纲、Gaiellales目、Gaiellaceae科、属，厚壁菌门包括Bacilli纲、Bacillales目、Bacillaceae科、属。

基于门分类水平下，最大的是变形菌门，在各个处理中，比例是T1（40%）>T3（34%）>T2（33%）>CK（28%）；第二大类群是厚壁菌门，在各个处理中，比例是 T1（14%）> T3（12%）>T2=CK（11%）；第三大类群是酸杆菌门，在各个处理中，比例是T3（15%）>T2（14%）>T1（12%）> CK（11%）；第四大类群是放线菌门，在各个处理中，比例是T2（15%）>CK（14%）>T3（12%）>T1（10%）；第五大类群是拟杆菌门，在各个处理中，比例是T1（13%）>CK（12%）>T3（11%）>T2（10%）；第六大类群是芽单胞菌门，在各个处理中，比例是T2=CK（6%）>T3（5%）>T1（3%）；在各个处理的其它菌中，比例是CK（18%）>T2=T3（11%）>T1（8%）。与间作处理相比，对照（CK）在变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门所占比例最小，而在放线菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门所占比例稍有提高，但和间作处理的差异不显著。

在这6个优势菌群中，与CK的丰度相比，T1、T2、T3处理在变形菌门上分别提高了42.86%、17.85%和21.43%，厚壁菌门上分别提高了27.27%、0%和9.09%，酸杆菌门上分别提高了9.09%、27.27%和36.36%，放线菌门上T2处理提高了7.14%而T1和T3处理分别下降了28.57%和14.30%，拟杆菌门上T1处理提高了8.33%而T2和T3处理分别下降了16.67%和8.33%，芽单胞菌门上T1和T3处理分别下降了50%和16.67%。

2.2.3 细菌群落结构组成的差异性

PCoA分析（图6A）中不同颜色的点表示来源于不同的样本，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。重叠的部分说明土壤细菌群落结构组成有一定的相似性，但PC1轴（49.72%）与 PC2轴（21.08%）的累计贡献量达到 70.80%；其中CK处理和T1、T2、T3处理在PC2轴的方向上分离开来，说明PC2是引起对照与间作处理分开的主要因素，同时这个因素也可能导致了对照处理与间作处理烟株根际土壤细菌群落的差异。

图6 烤烟连作和间作条件下根际土壤细菌群落结构PCoA和LEfSe分析

为了比较间作和连作烟株间的显著性差异物种，从门到科水平对各个处理进行LEfSe分析，检测具有显著丰度差异的细菌群落，仅LDA 得分值大于4的被展示（图6B、图6C）。T1处理差异指示细菌为Chitinophagales目、Chitinophagaceae科，T2处理差异指示细菌为Vicinamibacteria纲、Vicinamibacterales目、Vicinamibacteraceae科、Blastocatellia纲、Thermoleophilia纲、Actinobacteriota门、Pyrinomonadales目、Pyrinomonadaceae科、属，T3处理差异指示细菌为Acidobacteriales目、Acidobacteriaceae_Subgroup科、JG30_KF_AS9科、Ktedonobacteriales目、Acidobacteriae纲，对照差异指示细菌为unidentified_bacteria纲、Gemmatimonadales目、Gemmatimonadaceae科。

2.3 根际土壤细菌的Tax4Fun功能预测

对各个处理的植物根际土壤细菌群落的代谢预测结果表明（图7）：在一级功能层共获得细胞过程（Cellular processes）、环境信息处理（Enviromental Information Processing）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、人类疾病（Human diseases）、代谢（Metabolism）、有机系统（Organismal systems）和Unclassified（表示目前采用的数据库中未能找到与之相匹配的分类信息）七类生物代谢通路功能。其中，各个处理在环境信息、遗传信息和代谢上为其功能预测主要组成。

二级功能层有44条代谢通路功能组成，间作处理中，行使环境信息处理功能类别中编码细胞膜运输（Membrane transport）、行使遗传信息处理功能类别中编码复制与修复（Replication and repair）和翻译（Translation）、行使代谢功能类别中氨基酸代谢（Amino acid metabolism）和碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）功能的细菌群落丰度显著增加（图8）；在这有显著差异的5个二级功能层上，与CK的丰度相比，T1、T2、T3处理在细胞膜运输功能上分别提高了96.54%、88.96%和92.68%，在复制与修复功能上分别提高了26.93%、25.04%和23.81%，在翻译功能上分别提高了24.99%、27.76%和26.64%，在碳水化合物代谢功能上分别提高了13.79%、23.75%和20.12%，在氨基酸代谢功能上分别提高了28.85、32.21%和34.21%。这可能是因为间作作物根系分泌的次生代谢产物导致周围土壤环境发生变化，即改变了烤烟根际土壤的微生物区系，从而影响根际土壤微生物群落的功能。

图7 烤烟连作和间作条件下根际土壤细菌群落功能预测

图8 烤烟连作和间作条件下差异显著的二级功能层根际土壤细菌群落丰度

3 讨论

3.1 间作对连作烟田根际土壤细菌群落结构特征的影响

间作处理烟田烟株根际土壤细菌的丰度、多样性和均匀度均显著高于对照连作烟田的，这与景艺卓 等[26]研究结果基本一致。此外，间作烟株根际土壤不仅总OTU数目多，其特有的OTU数也多，尤其是T1处理特有的OTU数显著多于T2、T3和CK处理，这可能与小葱根系分泌物比苦苣和油菜根系分泌物增加土壤细菌丰度和多样性的效果更显著有关。

3.2 间作对连作烟田根际土壤细菌群落结构组成的影响

虽然所有处理在门水平上的优势菌均是变形菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门，这与前人的研究结果相近[27-30]。但与对照烟株根际土壤细菌相比，在门水平上，间作处理的芽单胞菌门和其它菌门的相对丰度降低，而变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门的相对丰度提高；这可能会导致对照烟田的烟株根际能更好地利用土壤中的硝态氮肥以供烟株生长所需的养分，而间作烟田的烟株除了能充分利用土壤中的有机质供烟株生长外，还能在一定程度上抵抗真菌类病害的发生。

3.3 间作根际土壤细菌功能预测

有很多研究表明，在相同的环境条件下，土壤微生物的群落组成可能相似，但行使功能的微生物种类可能存在很大差异，所以分析土壤微生物群落组成对揭示微生物群落的功能显得尤为重要[31]。

虽然本试验间作处理和对照处理在7条代谢通路（一级功能层）相似，但在二级功能层的碳水化合物代谢、氨基酸代谢、细胞膜运输、复制与修复、翻译5条通路上的丰度值显著高于对照；结合LEfSe分析推测：间作处理烟株根际土壤中的优势群落变形菌门的α-变形菌主要功能除参与光合作用外，还参与了碳循环[32]；拟杆菌门的鞘氨醇盒菌属和鞘氨醇单胞菌属能够产生多种多肽类氨基酸类抗生素[33]；厚壁菌门可以产生芽孢抵御外界的有害因子，具有极强的抗逆 性[34]；酸杆菌门除了能够降解植物残体多聚物和通过光合作用来调控植物的生长发育外，还具有生物修复能力[35]。

本研究表明间作处理根际土壤功能细菌与对照不同，其中差异指示细菌T1处理主要为Chitinophag- aceae、T2处理主要为Actinobacteriota、T3处理主要为Acidobacteriales、CK处理主要为Gemmatimon- adaceae，这可能是由于不同间作植物的根系在其生长发育过程中不断向周围释放大量的不同的分泌物，这些分泌物改变了与其进行间作的烤烟根际环境，最终导致烤烟烟株土壤微生物区系发生变化。诸多研究也揭示了作物间的根际分泌物可以作为信号分子来调节根际微生物种群[36-37]，不仅对于利用间套作种间根系相互作用提高养分利用效率有重要意义，而且对于利用生物多样性原理提高土壤生态系统生产力和稳定性有重要的指导作用。

4 结论

本研究通过 Illumina MiSep 高通量测序分析，研究了烤烟连作及其与小葱、苦苣、油麦菜3种植物间作对烟株根际土壤细菌群落组成及其功能。结果表明间作改变了连作烟田烟株土壤细菌的群落结构，增加了其多样性和功能；在门水平下，间作处理的差异优势根际土壤细菌功能主要集中于光合作用、碳氮循环、多肽类氨基酸类抗生素、吸收营养物质和生物修复能力方面，与细菌功能预测的分析基本一致，说明间作可以达到良好的生物改良连作烟田的效果。

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Effect of intercropping on the composition and function of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco plants

ZHONG Jun1, ZHOU Muqiu1, DAI Bin2, WU Wencheng1, HE Yi2*

1 College of agriculture, Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan province；2 Bijie branch of Guizhou tobacco company,Bijie,Guizhou province

[Objective] At present, the common continuous cropping of flue-cured tobacco seriously restricts the development of modern tobacco agriculture. This study aims to explore the use of the intercropping of flue-cured tobacco with shallot, chicory and oilseed rape to alleviate the continuous cropping obstacles, providing reference for eliminating the continuous cropping obstacles in tobacco soil.[Method] The 16S RNA high-throughput sequencing technology was used to determine and analyze the bacterial community structure of the rhizosphere soil of intercropping flue-cured tobacco plants, where the rhizosphere soil of continuous cropping flue-cured tobacco was taken as control; Tax4Fun function was used to predict the ecological function of the corresponding sample bacterial community. [Results] The OTU, abundance and diversity of rhizosphere soil bacteria in intercropping were higher than those in monoculture (CK). Compared with CK, the abundance of T1(intercropping shallot), T2(intercropping chicory), and T3(intercropping oilseed rape) treatments increased by 16.52%,12.10%,6.28%, respectively; while the OTU total number of T1, T2 and T3 treatments were increased by 6.00%,0.65%,3.49%, respectively. Compared with the abundance of CK at phyla level, the abundance ofunder T1, T2 and T3 treatments was increased by 42.86%,17.85%,21.43%,that ofunder T1, T2 and T3 treatments was increased by 27.27% , 0% , 9.09%, that ofunder T1, T2 and T3 treatmentsincreased by 9.09% , 27.27%, 36.36%, that oftreatment was increased by 7.14% under T2 while, decreased by 28.57% and 14.30% inunder T1 and T3 treatments, that ofwas increased by 8.33% under T1 treatment while decreased by16.67% and 8.33% under T2 and T3 treatments, that ofdecreased by150% and 16.67% under T1 and T3 treatments, respectively; On the 5 secondary functional layers with significant differences, compared with CK, the membrane transport capacity under T1, T2 and T3 treatments were increased by 96.54%,88.96%,92.68% respectively, increased by 26.93%,25.04%,23.81% in replication and repair, increased by 24.99%,27.76%,26.64% in translation, increased by 13.79%,23.75%,20.12% in carbohydrate metabolism, and increased by 28.85%,32.21%,34.21% in amino acid metabolism.[Conclusion] Intercropping significantly increased the richness and diversity of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco plants, changed the structure of soil microbial population, and enhanced the overall metabolic ability and genetic information processing ability.

flue-cured tobacco; intercropping; rhizosphere soil; bacterial community; composition; function

Corresponding author. Email：526525502@qq.com

贵州省烤烟公司毕节市公司项目（2022520500240196）

钟军（1973—），教授，博士，主要从事烤烟遗传育种研究，Email:zhhjp2005@126.com

何轶（1983—），研究员，博士，主要从事烟草生产研究，Tel：13397609408，Email:526525502@qq.com

2022-11-02；

2023-03-31

钟军，周慕邱，戴彬，等. 间作对烤烟烟株根际土壤细菌群落结构组成及功能的影响[J]. 中国烟草学报，2023，29（5）. ZHONG Jun, ZHOU Muqiu, DAI Bin, et al. Effect of intercropping on the composition and function of bacterial community in rhizosphere soil of flue-cured tobacco plants[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2023,29(5). doi:10.16472/j.chinatobacco. 2022.187