有机配体对超富集植物转运及解毒镍、锌的影响

莫冰岚,李 蕾,胡尊河,邓腾灏博①,曹 越,汤叶涛,仇荣亮,,4,5

(1.华南农业大学资源环境学院,广东 广州 510642;2.广东省农业科学院农业质量标准与监测技术研究所,广东 广州 510640;3.中山大学环境科学与工程学院,广东 广州 510006;4.岭南现代农业科学与技术广东省实验室,广东 广州 510642;5.广东省农业农村污染治理与环境安全重点实验室,广东 广州 510642)

1977年,BROOKS等[1]首次提出了“hyperaccumulator”(超富集)这一概念,用来描述植物地上部镍(Ni)含量超过1 000 mg·kg-1(干重)的特殊植物。随后有学者进一步将超富集的概念从Ni拓展到Zn、Cd等重金属,并将其定义为地上部重金属含量比普通植物高2个数量级且比同一污染环境中的普通植物高1个数量级的特殊植物[2-4]。达到“超富集”的判定标准是植物叶片或地上部(干重)中镉(Cd)含量达100 mg·kg-1,砷(As)、钴(Co)、铜(Cu)、镍(Ni)、铅(Pb)含量达1 000 mg·kg-1,锰(Mn)、锌(Zn)含量达10 g·kg-1以上[5]。截止目前,已有721种植物被判定为超富集植物[6-7]。由于这类植物具有超量富集重金属的能力及对金属特定的指示性,已广泛应用于植物修复、植物采矿和植物找矿中[8]。同时,超富集植物特殊的重金属吸收、转运及解毒机制也受到了广泛的关注。与普通植物相比,超富集植物根部通过高量表达重金属吸收转运载体,从而能够快速吸收大量重金属,同时通过提高重金属的根部径向运输能力以及木质部装载能力,将其高效转运至地上部进行储存解毒[9]。在这个过程中,如何提高超富集植物中重金属的迁移能力并缓解其毒性是一个重要的研究课题,而有机配体可能在这个过程中发挥了关键的作用。有机配体是指可与金属离子发生配位并具有生物功能的有机物,一般可分为氨基酸类、有机酸类和多肽类物质等。有机配体在超富集过程中主要起到金属解毒和增强金属的移动性等作用[10]。Ni和Zn超富集植物的种类丰富,具有良好的应用潜力,因此受到了学界的广泛关注,其中有机配体的研究也相对深入。因此,笔者重点总结梳理了Ni/Zn超富集植物体内主要的有机配体及其对金属吸收、转运和解毒过程的影响,以期为植物耐受重金属胁迫的生理生态机制及超富集植物的应用提供参考。

1 Ni/Zn超富集植物体内的主要配体

有机配体易与重金属离子形成稳定的螯合物,对金属离子的移动性及毒性具有重要的影响。超富集植物含有高量的重金属,其体内螯合物以易合成、含量丰富的小分子配体为主。目前研究发现超富集植物体内主要的有机配体包括烟草胺、组氨酸、有机酸等,其化学结构如图1所示。

图1 超富集植物体内主要有机配体的化学结构

1.1 氨基酸类配体

1.1.1组氨酸

组氨酸(histidine,His)是在1896年被INGLE等[11]发现的三齿配体,由于它存在羧基、氨基和咪唑环,能够与重金属离子形成较稳定的复合物。His的咪唑基团在生理pH值(7.35～7.45)条件下可以在质子化和去质子化状态之间交替[12-13]。因此,His可与酸、碱发生化学反应,这决定了它能存在于许多酶的活性位点中。His与重金属的结合能力相对较强,且无论是在微酸还是在偏碱性pH值条件下,His和Ni等金属形成的复合物稳定常数都较高[14]。因此,组氨酸是植物细胞中重要的金属配体。

1.1.2烟草胺

烟草胺(nicotianamine,NA)是非蛋白质氨基酸,它由3个S-腺苷-甲硫氨酸分子的3个氨基-羧丙基基团通过NA合酶的酶促缩合产生。分子中3个氨基和3个羧基的存在允许形成六齿配位,从而驱动与中心金属离子形成非常稳定的八面体螯合物[14]。NA是植物合成铁载体(如麦根酸)的前体物质,最初被发现与铁代谢有关:NA可与Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)结合形成稳定的复合物,从而保证了Fe在植物体内的移动性[15]。不久后它被证明对铜代谢也很重要[16]。另外,有报道显示,在超富集植物体内发现了Zn与NA的结合[17]。NA能与Mn、Fe(Ⅱ)、Zn、Co、Ni和Cu 按亲和力递增的顺序形成稳定的螯合物[18](表1)。

表1 苹果酸、柠檬酸、组氨酸、烟草胺和EDTA与重金属的配合物稳定常数(lg K)

1.2 有机酸类配体

有机酸广泛存在于植物体内,是一种带有1个或多个羧基的低分子量的碳氢氧化合物。有机酸是光合作用的产物,其主要在线粒体中通过三羧酸循环产生,少量产生于乙醛酸循环体[19]。在重金属进入植物体内后,重金属可与有机酸结合,从而有效降低其与细胞内蛋白和酶结合的机会,起到降低重金属生理毒害作用[20]。因为植物通常在液泡中储存高浓度的苹果酸等有机酸,所以重金属进入液泡将不可避免地与有机酸结合。在液泡的酸性pH值(5～6)条件下,重金属与有机酸结合形成的复合物稳定性较高。因此,有机酸可能在植物液泡区室化重金属过程中扮演重要角色。但值得注意的是,有机酸与重金属形成的配合物稳定常数(lgK)明显低于NA和His等配体[21],这也说明有机酸和重金属的结合不存在太强的特异性。

2 有机配体在Ni/Zn超富集植物体内的作用机制

根部迁移及解毒、木质部转运和叶片解毒等过程是超富集植物从根际土壤吸收重金属并将其转移、富集到地上部的主要调控过程,也是超富集植物区别于普通植物的关键生理机制。有机配体也在这些超富集过程中发挥了重要的作用(图2)。

(1)根部吸收;(2)根部区室化;(3)木质部装载;(4)木质部运输;(5)木质部卸载;(6)叶片区室化。

2.1 根部迁移及解毒过程

高含量的重金属离子被吸收进入植物根部细胞后会对细胞产生强烈的毒害作用。在细胞质基质偏碱性(pH=7～8)的环境下,氨基酸类物质与重金属的络合能力较强,故细胞质基质中的金属离子倾向于与氨基酸类有机配体结合,从而有效提高重金属的移动性并缓解其毒性[22-23]。现有研究表明,超富集植物根部通常含有较高浓度的氨基酸类配体。例如,KERKEB等[24]研究发现,Ni 超富集植物Odontarrhenalesbiaca的根部His浓度是非富集植物印度芥菜(Brassicajuncea)的5倍以上。而针对Ni/Zn超富集植物天蓝遏蓝菜(Noccaeacaerulescens)的研究也有类似发现:其根部His浓度是非富集植物菥蓂(Thlaspiarvense)的10倍,但2种植物叶片中的His浓度则相差不大[32]。SALT等[13]针对超富集植物天蓝遏蓝菜的研究发现,根细胞中55%～70%的Zn与His结合。Ni或Zn与His形成的复合物可有效阻止其向根部液泡的转运,从而显著降低了Ni/Zn的液泡区室化作用,增强了其根部的径向移动性以及木质部装载能力[25-27]。外部添加实验也证实,His在水培溶液的添加可显著提高非富集植物B.juncea向地上部转运Ni的能力[24]。

而与His类似,NA也可能在金属的根部迁移过程中发挥了重要作用。例如,Zn超富集植物鼠耳芥(Arabidopsishalleri)根部NA的合成能力比与之同属的非富集植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)强[28]。DAMIEN等[29]通过体积排阻色谱-ICPMS联用的方法测定了鼠耳芥根部Zn的形态,发现Zn主要与NA以及巯基类化合物结合;通过基因工程手段将鼠耳芥植株的NA合成酶(NAS)基因沉默后,植物根部的NA含量出现了大幅下降,而Zn在地上部的含量也出现了大幅降低,表明NA在植物根部Zn的转运过程中扮演了重要的角色。另一方面,NA在重金属解毒过程中也发挥了重要作用。例如,CHEN等[30]将东南景天(Sedumalfredii)SaNAS1基因异源表达在非富集植物拟南芥中,结果发现植物体内Zn的浓度出现了显著提高,对高Zn胁迫的耐受性也得到了提升。类似的是,PIANELLI等[31]将天蓝遏蓝菜的NcNAS基因转移至非富集植物拟南芥体内表达,发现植株体内的NA含量升高了100倍,其对Ni的耐受性及转移能力也得到了大幅提高。这些研究结果表明,NA与Ni、Zn的结合一方面降低了金属离子的在细胞内的毒性,另一方面也提高了其在共质体的移动性,促进了其径向运输能力。

一般而言,超富集植物根部液泡对重金属的区室化能力较差。但当其长时间培养在相对高浓度的重金属环境下,重金属仍会被大量转移到根部液泡中储存[32]。根部液泡呈酸性(pH=5～6)且含有较高浓度的有机酸,因此在液泡中金属可能主要与有机酸结合。例如,BOOMINATHAN等[33]研究Ni超富集植物Odontarrhenabertolonii发现,在25 mg·L-1的Ni处理下其根部28%的Ni与有机酸(柠檬酸、苹果酸和丙二酸)结合。SARRET等[34]通过EXAFS探索了生长在Zn污染土壤中的超富集植物鼠耳芥根部Zn的赋存形态,发现其根部的Zn主要与柠檬酸、苹果酸及磷酸盐结合。但SHEN等[35]对比了超富集植物天蓝遏蓝菜及非富集植物Thlaspiochroleucum体内有机酸的含量,发现两者并没有显著的区别。可见有机酸的含量并非金属解毒及超富集的决定性因素。

2.2 木质部转运过程

植物从土壤中吸收Ni、Zn后,通过根部共质体径向运输到达木质部薄壁细胞,随后主要通过金属外排转运载体(如HMA4蛋白[36]、YSL蛋白[37])将其以重金属离子或重金属-配体复合物的形式装载进入木质部[38]。木质部是连接地上部和根部的通道,也是植物的非生命部分,主要由厚壁死细胞组成[39]。近年来,超富集植物木质部运输过程得到了较为广泛的研究。例如,KRMER等[16]首先报道了Ni超富集植物O.lesbiaca木质部汁液中Ni的主要形态,主要通过EXAFS并结合模型计算的结果显示,48%的Ni以离子态形式存在,其他的Ni则与组氨酸 (19%)、谷氨酸 (15%)、柠檬酸 (9%) 和苹果酸 (3%) 结合;ALVES等[40]的田间调查发现,生长在蛇纹岩地区的超富集植物Odontarrhenaserpyllifoliassp.lusitanicum,其木质部汁液中70%的Ni为水合离子态,其他部分则被有机酸螯合,如柠檬酸 (18%)。CENTOFANTI等[41]的研究显示,在几种齿丝荠属 (Odontarrhena) 超富集植物中,木质部汁液中Ni的有机螯合物 (包括有机酸和氨基酸等) 含量要远远低于Ni离子的浓度,说明Ni在木质部转运过程中应该主要以离子形态存在。

对Zn超富集植物的研究也有类似的结论。SALT等[13]对Zn超富集植物天蓝遏蓝菜的研究表明,木质部汁液中Zn主要以离子形态为主(79%),剩余部分则与柠檬酸络合(21%)。LIU等[42]通过EXAFS检测了Zn超富集植物东南景天木质部汁液中Zn的形态,发现Zn同样以水合Zn离子的形态(>55.9%)为主,其余部分的Zn则与柠檬酸结合(36.7%～42.3%)。

总体而言,由于木质部汁液呈酸性(pH=5～6),且运输的有机配体浓度较低,因此金属主要以水合离子形式赋存,少部分则以金属-有机配体的形式赋存(表2)。

表2 木质部汁液中金属赋存形态及其占比

2.3 叶片解毒过程

叶片的生物量大、赋存的重金属浓度高是超富集植物积累及解毒重金属的主要器官。木质部运输的金属到达叶片后,通过叶脉传递到整个质外体空间。这时金属或者被叶肉细胞吸收,或者保留在质外体中[43]。BROADHURST等[44]研究发现,Ni超富集植物齿丝荠(Odontarrhenachalcidica)叶片中Ni的首要存储部位是表皮细胞。LEE等[45]研究发现,新喀里多尼亚蛇纹岩地区的多种木本超富集植物叶片中的Ni主要以柠檬酸结合态的形式存在。另外,在欧洲的齿丝荠属(Odontarrhena)的超富集植物中,Ni则主要被苹果酸和丙二酸螯合[46]。

3 有机配体合成与调控的分子机制

超富集植物赋存的高量金属结合有机配体表明其体内存在特殊的配体合成基因表达及调控通路。但现阶段针对有机配体在超富集植物体内合成的相关分子机制还缺乏系统性的探索,下面以超富集植物重要的有机配体(如烟草胺、组氨酸等)为例介绍相关的分子机制。

3.1 烟草胺

NA的生物合成涉及2步反应,需要2种酶参与催化,分别是S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAMS)和烟草胺NA合酶(NAS)。其中,SAM基因可编码SAM合酶,SAM合酶催化合成NA的前体物质SAM,SAM在NAS的催化下合成NA。有研究表明,无论外界Zn浓度如何变化,超富集植物鼠耳芥的SAM转录水平都维持高位;而非富集植物拟南芥只在过量的Zn处理下SAM转录水平才会升高[52-53]。而NAS基因在超富集植物鼠耳芥和天蓝遏蓝菜中均被发现存在组成型高量表达现象[36]。MARI等[54]研究发现,天蓝遏蓝菜只在地上部表达NcNAS1,其根部赋存的高浓度NA可能是通过韧皮部转移到根部储存。CHEN等[55]从东南景天中分离出4个SaNAS基因:SaNAS2、SaNAS3、SaNAS4和SaNAS5。RT-PCR分析表明,在Cd胁迫的条件下,4个SaNAS基因在根部组织高量表达;而在Zn胁迫的条件下,只有SaNAS2、SaNAS3、SaNAS4这3个基因表达上调。总体而言,NA合成相关基因的过表达可能是植物超富集Zn的关键机制之一。

3.2 组氨酸

植物体内L-组氨酸的合成经历10步反应,9种酶参与催化,其中ATP-PRT、IGPD和HDH被认为是His合成过程中的限速酶。与其他氨基酸不同,大部分合成His的酶是由单拷贝基因编码[56]。前人主要探索了Ni超富集植物His合成的分子机制。PERSANS等[57]研究显示,Ni超富集植物N.goesingense合成His的3种限速酶基因不受Ni的调控,即Ni胁迫不会改变3种基因的表达和植物体内His的浓度,说明其体内His的合成是持续的,与外界的影响无关。INGLE等[56]的研究表明,与非富集植物相比,Ni超富集植物O.lesbiaca中的His合酶基因HISN1A和HISN1B的高量表达与根部游离His浓度的增加密切相关。总体而言,Ni超富集植物体内His合成基因的表达量相对较高,但对其转录调控仍知之甚少。

3.3 其他

ZHAO等[58]对超富集植物商陆(Phytolaccaamericana)进行Cd处理发现,植物中蛋氨酸的生物合成上调,蛋氨酸是合成SAM的前体,而SAM是合成NA的前体,所以这可能是增加植物中的NA库以应对金属胁迫。SCHNEIDER等[59]对Zn超富集植物天蓝遏蓝菜的叶表皮和叶肉组织的蛋白质组学研究表明,表皮细胞通过积累更多的谷胱甘肽转移酶(GST)和GSH来适应高浓度的Zn。WANG等[60]对不同Cd 浓度处理下龙葵(Solanumnigrum)的代谢组学研究表明,随着 Cd 胁迫浓度的增加,大多数碳水化合物的浓度增加,表明龙葵主要通过激活其体内的能量代谢途径来减轻Cd的毒性。

4 有机配体及金属配合物的检测方法

有机配体在植物体内重金属解毒等方面发挥着重要作用。植物体内的有机配体可以通过液质联用(LC-MS)[61]、气相质谱联用(GC-MS)[61]和高效液相色谱-电喷雾/四极杆飞行时间串联质谱联用(LC-ESI-Q-TOF-MS)[62]等方法进行检测。而植物体内的金属配合物的检测方法[63]主要有红外光谱(FTIR)、电子自旋共振光谱(ESR)、X射线吸收光谱(EXAFS)、核磁共振(NMR)和LC-ESI-Q-TOF-MS。MCNEAR等[64]使用ATR-FTIR的方法研究Ni在超富集植物齿丝芥植物汁液中的形态,结果表明Ni在齿丝芥植物汁液和维管系统中主要与组氨酸、苹果酸盐等低分子有机配体结合。MERDY等[65]研究了小麦秸秆细胞壁残渣(CWR)对Cu(Ⅱ)的吸附作用,根据ESR的参数推断Cu(Ⅱ)离子与 CWR 络合时,与4个含氧基团以方平面排列方式配位。STRACZEK等[66]通过EXAFS观察烟草根系中Zn的配位,发现Zn主要与根细胞壁中的COOH/OH基团(总根系Zn的40%～80%)和细胞质基质中的有机酸(如柠檬酸盐和苹果盐)结合。UENO等[67]通过113Cd-NMR研究超富集植物天蓝遏蓝菜叶片中Cd的赋存形态,发现叶片中的Cd主要与苹果酸结合。TSEDNEE等[70]通过LC-ESI-Q-TOF-MS的方法测定了小麦样品中的Fe-PS配合物的含量。

5 展望

总体而言,超富集植物体内高量的小分子有机配体可能是其高效转运及耐受重金属的重要原因。目前该领域的研究仍存在较多空白,未来仍需针对重金属超富集植物螯合解毒、转运机制开展进一步的探索:

(1)超富集植物有机配体的种类及其作用有待进一步研究。目前的研究主要围绕组氨酸和烟草胺等几种配体,以及天蓝遏蓝菜、东南景天等几种超富集植物,对其他有机配体及植物品种的研究较少。不同超富集植物品种体内的配体是否具有特异性?未来需结合代谢组学方法对更多品种的超富集植物体内有机配体进行分析。

(2)氨基酸类配体的含量变化对超富集植物体内蛋白质合成的影响有待进一步研究。超富集植物持续合成高量的氨基酸类配体,是否会对植物体内其他氨基酸类物质的合成产生影响?超富集植物如何进行调控和平衡?目前这部分尚属于研究空白,未来需运用蛋白质组学等方法重点探索超富集植物中有机配体含量变化对其体内蛋白质合成的影响。

(3)超富集植物中有机配体的合成、调控及转运的分子机制有待进一步研究。例如,超富集植物持续高量表达NAS基因的调控信号来自哪里?植物体内的有机配体如何在植物根部-地上部进行循环运输?未来需运用分子生物学和系统生物学等方法研究超富集植物中有机配体的合成、调控及转运的分子机制。

(4)有机配体在植物提取修复过程中的应用技术有待进一步研究。如何提高超富集植物地上部重金属的浓度是决定植物提取修复成败的重要难题。而有机配体是影响重金属向地上部转运的重要因素。未来可通过外部施加相关有机配体的方式,或通过筛选或构建超量合成有机配体的超富集植物品种,达到提高植物提取效率的目的。