低温条件下恩诺沙星的微生物降解研究

苏一鸣,王英刚,蔺 昕,李晓军

(1.沈阳大学环境学院,辽宁 沈阳 110044;2.中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁 沈阳 110016)

恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)是一种人工合成的动物专用喹诺酮类抗生素,具有抗菌谱广、活性强等特点,常用于畜禽感染性疾病的预防和治疗。进入畜禽体内的抗生素不会被全部吸收,约有30%～90%会随着尿液或粪便排出至环境中[1]。ENR是一种两性分子(pKa1=5.88～6.06,pKa2=7.70～7.74)[2],正常环境下亨利定律常数极低,挥发损失可忽略不计,但其辛醇-水分配系数(Kow)较低,易在土壤中积累和迁移,检出率高,威胁生态系统安全[3]。研究发现,在我国畜禽粪便中最常检出的抗生素为喹诺酮类,其中猪粪中ENR平均检出含量达4.68 mg·kg-1[4]。我国农田土壤中ENR的检出率高,残留含量范围为0～1 347.6 μg·kg-1,均值介于0～99.4 μg·kg-1之间[5],最大值接近澳大利亚农田土壤标准值(370 μg·kg-1)的4倍[6]。长三角典型城郊地区农田、林地和园地的ENR检出率高达70%以上,农田的检出率达100%[7]。邰义萍等[8]调查了东莞市18个区镇24个代表性蔬菜基地土壤中喹诺酮类抗生素的含量,结果表明4种喹诺酮类抗生素的检出率均在90%以上,以恩诺沙星(平均含量19.85 μg·kg-1)为主,部分含量超过了抗生素生态毒害效应触发值(100 μg·kg-1)。邰义萍等[9]研究珠江三角洲地区长期施用粪肥的无公害蔬菜生产基地发现,土壤中喹诺酮类抗生素平均含量为17.99 μg·kg-1,恩诺沙星的检出率为100%,平均含量为3.52 μg·kg-1。

我国北方地区秋冬季气温低,持续时间长,较大限制了中高温菌的应用,因此增强低温降解菌的研究对于低温地区的土壤抗生素污染治理具有重要意义。邢慧珍[15]研究发现,菌株SDF-25的最适生长温度为10～16 ℃,10 ℃培养15 d后秸秆降解率为39.5%,16 ℃时达44.9%。郭平[16]筛选出6株低温石油降解菌,均能在0 ℃降解石油烃,其中菌株Rhodococcussp.在0 ℃、原油初始质量浓度为5 g·L-1、菌液接种量φ=10%条件下降解60 d后生物降解率可达52.6%±2.0%。畜禽粪便堆放地土壤通常具有较高的含盐量和抗生素含量,因此筛选耐盐的恩诺沙星降解菌十分必要,目前关于适应北方低温耐盐环境的恩诺沙星降解菌还鲜见报道。

笔者以污染土壤中常见的喹诺酮类抗生素—恩诺沙星为目标污染物,利用低温地区畜禽粪便堆放地土壤,筛选出恩诺沙星低温高效降解菌,在明确降解菌的生长和降解特征基础上,研究低温对菌株生长和恩诺沙星降解能力的影响,为适用于北方低温地区抗生素污染土壤生物修复技术的构建提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1试剂与培养基

无机盐(MSM)培养基:1 L水、1 g (NH4)2SO4、1 g KHPO4、1 g K2HPO4、0.5 g NaCl、0.05 g FeC13·6H20、0.02 g CaC12·H2O、0～10 g葡萄糖,pH值为7.2～7.4。LB培养基:1 L水、10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl,pH值为7.2～7.4(固体培养基加20 g琼脂)。

恩诺沙星储备液:准确称取恩诺沙星标准品0.010 0 g,用V(乙腈)∶V(水)=1∶1超声溶解并定容于100 mL容量瓶中,配制成ρ为100 mg·L-1的恩诺沙星标准液,在-20 ℃冰箱中避光保存,1个月内使用[17]。实验中用到的各浓度梯度标准液(5～500 μg·L-1)均用甲醇(φ=1%甲酸)稀释。

1.1.2低温恩诺沙星降解菌的筛选

考虑到高纬度和高海拔地区的低温特点,采集辽宁省海城市和青海省西宁市某畜禽养殖场粪便堆放区土壤,应用梯度驯化培养技术,分离筛选出低温高效恩诺沙星降解菌。

称取1.5 g冷鲜土样置于装有30 mL无机盐(MSM)培养基的锥形瓶中,按φ=5%接种量进行梯度驯化培养,将恩诺沙星储备液稀释至10 mg·L-1后,加入培养基各0.3、0.6、1.2、2.4 mL,使培养基中恩诺沙星浓度分别为100、200、400、800 μg·L-1,15 ℃、150 r·min-1避光振荡,依次培养5 d。经4次梯度培养后,选择800 μg·L-1浓度下能够耐受恩诺沙星的混合菌液转接到含有800 μg·L-1恩诺沙星的固体LB培养基上进行划线培养,15 ℃避光条件下每隔5 d对生长出来的微生物进行转接,共转接6次,使得培养基中菌株得以分离纯化,最终获得若干单一菌株。

将分离纯化的单一菌株以5%接种量接种到恩诺沙星含量为500 μg·L-1的MSM培养基中进行降解实验,15 ℃、150 r·min-1避光振荡培养5 d,测定培养基中恩诺沙星的含量,最终筛选出4株恩诺沙星高效降解菌Z、H5、H35、Y用于后续实验。

上述菌株经上海生物工程有限公司鉴定,Z为普罗威登斯菌属(Providenciasp.),H5为肠杆菌属(Enterobactersp.),H35为普罗威登斯菌属(Providenciasp.),Y为产碱杆菌属(Alcaligenessp.)。

1.2 菌株生长和降解特征

1.2.1菌株的生长曲线

向50 mL LB液体培养基中加入4种菌悬液2.5 mL(不投加恩诺沙星),15 ℃、150 r·min-1避光振荡培养6 d,分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、48、72、96、120、144 h[14]取样测定菌液浓度OD600。

1.2.2pH值对菌株生长的影响

针对4种菌株,向20 mL LB液体培养基中加入菌悬液各1 mL,每株菌利用HCl或NaOH溶液再设置不同的pH值处理(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0),每种处理均设置3个重复,15 ℃、150 r·min-1避光振荡培养,由菌株生长曲线可知,培养72 h菌液OD600达到峰值,因此培养3 d后取样测定4种菌株在不同pH值处理浓度菌液下的OD600。

1.2.3菌株对恩诺沙星的降解能力

考虑到北方秋冬季气温在10 ℃以下,因此测定8 ℃环境下菌株对恩诺沙星的降解能力。向50 mL液体LB培养基中加入恩诺沙星标准储备液0.25 mL,使恩诺沙星的浓度为500 μg·L-1,再加入4种菌悬液2.5 mL,8 ℃、150 r·min-1避光振荡培养14 d,为排除细菌吸附作用对恩诺沙星浓度的影响,分别设置不接菌的培养基和灭活菌液的对照处理,分别在0、2、4、6、8、10、12、14 d取样测定培养基中恩诺沙星的含量,每个处理设置3个重复。

1.3 低温对菌株生长及其对恩诺沙星降解能力的影响

1.3.1低温对菌株生长的影响

向20 mL液体LB培养基中加入4种菌悬液1 mL,在4、8、15 ℃温度下,150 r·min-1避光振荡培养15 d,分别在0、1、3、6、9、12、15 d取样测定菌液浓度OD600,直到菌株死亡,每种处理设置3个重复。

1.3.2低温对菌株恩诺沙星降解能力的影响

鉴于实际水体中恩诺沙星的检出量多在500 μg·L-1以下,因此选择500 μg·L-1为恩诺沙星初始浓度。向20 mL液体LB培养基中加入恩诺沙星标准储备液0.1 mL,使恩诺沙星的质量浓度为500 μg·L-1,再加入4种菌悬液1 mL,分别在4、8、15 ℃温度下150 r·min-1避光振荡培养,不接菌的空白培养基作为对照。

由低温对菌株生长的影响结果可知,4种菌液在培养14 d时菌液浓度OD600达到峰值,对恩诺沙星的降解效果最好,因此选在第14天取样测定培养基中恩诺沙星的浓度,每个处理设置3个重复。

1.4 样品检测与分析

菌液浓度(OD600)测定:用分光光度计测定细菌培养液在600 nm处的吸光值(OD600)。OD600超过1,则稀释适当倍数后测定。

样品前处理:实验样品取样测定时,取1 mL摇匀的待测菌液,用0.22 μm孔径无菌滤膜过滤至1.5 mL液相进样瓶中,避光保存于-20 ℃冰箱。

恩诺沙星浓度测定:利用超高效液相-三重四级杆质谱联用仪(Triple Quad 5500+ QTRAP Ready,美国AB SCIEX)进行测定[18]。

色谱条件:采用Ailent Eclipse Plus C18(1.9 μm,150 mm×2.1 mm)色谱柱,柱温40 ℃,柱平衡时间 30 min,流速0.4 mL·min-1,进样量10 μL。流动相为5 mmol·L-1乙酸铵溶液(含1%甲酸)-乙腈,梯度为0～0.5 min (98%A相,2%B相)、0.5～3.0 min(98%A相,2%B相)、3.0～5.0 min(2%A相,98%B相)、5.0～5.1 min(2%A相、98%B相)、5.1～8.0 min(98%A相、2%B相)。

质谱条件:采用三重四级杆质谱检测器、电喷雾离子源(ESI)、多反应离子监测(MRM)模式。辅助气体55 mL·min-1,喷雾电压5 500 V,气帘30 mL·min-1,蒸汽温度550 ℃,恩诺沙星母离子m/Z为360.6,子离子m/Z为316.4/245.4,碰撞电压20/27 V,锥孔电压45 V。

在5～500 μg·L-1浓度范围内基准曲线的R2>0.99,回收率测定采用实际样品加标的回收率,测得加标回收率为92.1%,相对标准偏差(RSD)低于1%,空白对照组中均未检出恩诺沙星。

1.5 数据处理方法

恩诺沙星降解率(R)计算公式为

R=(C0-C)/C0×100%。

(1)

式(1)中,C为接菌处理的恩诺沙星浓度,μg·L-1;C0为不接菌对照处理的零时恩诺沙星浓度,μg·L-1。

运用单因素方差分析(ANOVA)比较各数据间的差异性,所有统计分析均在SPSS 26.0中完成,运用Origin 8.5进行图表绘制,图表中数据为平均值+标准差。

2 结果与分析

2.1 菌株的特征

2.1.1菌株的生长特征

图1表明了4种菌株在15oC条件下培养的生长过程差异。4种菌株的生长过程均经历先上升后达到稳定的过程,同一菌株不同培养时间OD600具有显著性差异(P<0.05)。不同菌株达到稳定的时间存在差异,H35和H5菌生长极为迅速,8 h接近稳定期,OD600分别达到峰值1.799和1.909,随后略有下降,但两者间无显著性差异(P>0.05);Z菌初期生长速率显著低于H35和H5(P<0.05),22～48 h接近稳定期,OD600达到峰值1.82;Y菌培养初期生长速率极为缓慢,OD600显著低于其他3株菌(P<0.05),48～72 h接近稳定期,OD600达到峰值2.483,显著高于其他3株菌(P<0.05),随后略有下降。

图1 4种菌株的生长曲线

2.1.2培养基pH值对菌株生长的影响

图2表明了pH值对4种菌株生长的影响。在pH =5.0～9.0范围内,H35、H5的生长不受pH值的影响,OD600值在不同pH值间无显著性差异(P>0.05)。H5的生长状况优于H35,其OD600值显著高于H35。Z更适于中性偏碱性环境,其OD600值在pH>6的处理之间无显著差异,在酸性环境中的OD600值显著低于碱性环境,且pH值越低,其OD600值越低。Y更适于中性环境,其在pH =7.0时生长良好,OD600达到2.013,酸性和碱性环境中的OD600值显著小于pH=7时的OD600值,且碱性越强,受抑制程度越强。

直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同pH值间OD600差异显著(P<0.05);英文小写字母不同表示同一pH值不同菌株间OD600差异显著(P<0.05)。

2.2 菌株对恩诺沙星的降解

图3表明了8 ℃条件下灭活菌株的对照组对恩诺沙星的吸附能力,随着培养时间的增加,灭活后的H5和Y对恩诺沙星的吸附率具有显著差异(P<0.05),Z和H35对恩诺沙星的吸附率则无显著变化,其中H35在培养2 d达到峰值2.81%。可以看出,14 d培养过程中4种菌株对恩诺沙星的吸附作用并不明显。

直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同降解时间吸附率差异显著(P<0.05);英文小写字母不同表示同一降解时间不同菌株间吸附率差异显著(P<0.05)。

4种菌株对恩诺沙星具有较好的降解能力,对恩诺沙星的降解率随培养时间的增长呈上升趋势。图4表明了8 ℃条件下4种菌株对恩诺沙星的降解过程。在14 d培养过程中,不接菌对照处理中恩诺沙星含量有所下降,14 d自降率为22.8%。Z、H5、Y对恩诺沙星的降解率在12 d达到最高,分别为49.6%、47.9%和48.1%;H35对恩诺沙星的降解率则在14 d达到最高,为56.5%,显著高于其他3株菌(P<0.05)。可以看出,在整个降解过程中Z和H35对恩诺沙星具有更好的降解能力,其中Z在培养的前期降解能力更强,而H35在培养的后期降解能力不断提升。

直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同降解时间降解率差异显著(P<0.05);英文小写字母不同表示同一降解时间不同菌株间降解率差异显著(P<0.05)。

2.3 低温对菌株生长及恩诺沙星降解的影响

2.3.1不同低温条件下菌株的生长情况

与图2的生长曲线对比可知,恩诺沙星抑制了菌株的生长。4株菌在4～15 ℃的温度范围内均能生长,但低温会在生长前期显著抑制微生物生长。温度越低,菌株前期生长越缓慢。15 ℃条件下4株菌生长迅速,0～9 d的菌密度显著高于8和4 ℃。9 d 以后4株菌不同温度之间的生长状况趋于一致(图5)。

图5 低温对4种菌株生长的影响

不同菌株对低温的响应特征不同。Y和Z生长特征趋于一致,4和8 ℃条件下生长速度均显著低于15 ℃。12 d时3个温度条件下的菌密度趋于一致。H35和H5不同温度下的生长规律相似,但3个温度下H35的OD600均在9 d达到最大值,随后持续下降,且3个温度下的OD600依然存在显著差异(15 ℃>8 ℃>4 ℃);而H5的OD600值在15、8和4 ℃达到峰值的时间点分别为9、12和14 d,12 d后15和8 ℃的OD600值无显著差异。

2.3.2不同低温条件下恩诺沙星的降解情况

图6表明不同低温条件培养14 d后菌株对恩诺沙星的降解情况(不包含自然降解率)。4、8、15 ℃条件下无菌对照组恩诺沙星的自然降解率分别为10.9%、22.8%、40.6%,说明低温抑制了恩诺沙星的非生物降解,同时低温显著抑制了菌株对恩诺沙星的降解效果,温度越低降解效果越差。但即使在低温情况下,菌株对恩诺沙星依然有降解效果。4 ℃条件下,Z、H5、H35和Y对恩诺沙星的降解率在14 d达到峰值,分别为33.4%、42.1%、38.1%和34.3%。

直方柱上方英文大写字母不同表示同一菌株不同温度条件降解率差异显著(P<0.05);英文小写字母不同表示同一温度条件不同菌株间降解率差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 菌株的特征

要实现污染物的微生物降解,微生物必须具备2个条件:能够接触到污染物和能够降解污染物。而要实现持续高效降解,则需要微生物降解目标污染物的效率高并保持足够的量。研究结果表明,15 ℃条件下H35、H5生长极为迅速,8 h接近稳定期,OD600达到峰值,随后略有下降。向培养基投加500 μg·L-1恩诺沙星后明显抑制了菌株的生长。H35菌培养9 d后OD600达到峰值2.84,显著高于其他3株菌。

要实现高效降解微生物的现场应用,构建合适的复合菌剂是低温条件下提高降解效率的有效途径[19]。研究发现,H35、H5菌的生长趋势相似,存在拮抗关系;但两者与Z和Y菌的生长速率具有差异性,且均能在低温下生长,对恩诺沙星耐性良好。韩婉雪等[20]研究发现,畜禽粪便堆放地土壤属于中性或偏碱环境。该研究的目的是筛选出适于该环境的降解菌,同时明确筛出菌对pH值的适应区间。结果表明,在pH =5.0～9.0时,H35、H5的生长不受pH值的影响,Z更适于中性偏碱性环境,Y更适于中性环境,说明4种低温菌株在畜禽污染场地具有应用潜力。因此,可以考虑将H35、Z、Y菌组合成复合菌系,以达到对恩诺沙星更好的降解效果。

过去关于微生物降解恩诺沙星的研究多适用于常温条件。梅瀚杰等[21]研究发现,菌株BSFL-3在33.6 ℃、初始pH =5.8、接种量4%、155 r·min-1条件下可使恩诺沙星的降解率达到77.83%±0.53%。潘兰佳等[22]利用嗜热菌Thermussp.C419在高温(70 ℃)条件下降解2种典型的喹诺酮类抗生素(诺氟沙星和恩诺沙星),降解率为60%～80%。谷雪维[23]研究发现,周丛生物膜对于恩诺沙星具有良好去除效果,去除率均在90%以上。王振方等[24]以绿藻门的胶网藻(Dictyosphaeriumsp.)为对象,通过12 d室内培养实验,发现胶网藻对于恩诺沙星的去除具有显著促进作用。可以看出,目前针对低温条件下的恩诺沙星降解菌还不多见。在该研究中,筛选出的4株菌在8 ℃时对恩诺沙星均有较好的降解能力。对恩诺沙星的降解率随培养时间的增长呈上升趋势,Z、H5、Y对恩诺沙星的降解率在12 d时达到最高,分别为26.8%、15.1%、25.3%;H35对恩诺沙星的降解率则在14 d时达到最高,为33.7%。4 ℃条件下,Z、H5、H35和Y对恩诺沙星的降解率在14 d时达到峰值,分别为22.5%、31.2%、27.2%和23.4%。

3.2 低温对菌株生长及恩诺沙星降解的影响

温度是影响菌株生长和菌株发挥降解作用的重要因素,尤其在高纬度地区温度严重影响着微生物的降解速率。目前在微生物修复中高温菌占主体,而在我国北方地区寒冷而漫长的冬季,低温会强烈抑制中高温菌对污染物的降解效率。低温显著抑制了菌株对恩诺沙星的降解效果,温度越低降解效果越差,但即使在4 ℃条件下,与不接菌对照相比,菌株对恩诺沙星依然有降解效果。许多学者也从其他低温环境中分离出低温降解菌,马文成等[25]从冬季活性污泥中筛选得到具有高生物活性的耐冷细菌,张鑫等[26]筛选得到的复合菌系M44在15 ℃条件下能够高效降解玉米秸秆。ERIKSSON等[27]从2个北极土样和2个高纬度北方土样中分离出对有机物具有高效降解率的优势菌株。以上结果表明,增强低温降解菌的研究对于我国低温地区的土壤污染治理具有重要意义。

4 结论

微生物降解可以有效降低抗生素生态环境风险。低温微生物对恩诺沙星具有降解作用,即使在4 ℃条件下,4株菌对恩诺沙星的降解率依然达到20%以上,但总体随着温度降低降解效果削弱。其中Z菌株和H35菌株在低温条件下(4～15 ℃)对恩诺沙星具有更好的降解能力,Z在培养前期降解能力更强,而H35在培养后期降解能力不断提升,这为我国北方和高纬度地区抗生素污染土壤修复提供了一定的技术支撑。