固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮用水中的氨基酸污染物

赵妮娜

（四川省广元生态环境监测中心站，四川 广元 628017）

引言

氨基酸（AAs）是地表水中有机氮的重要组成部分，占海水中溶解有机氮（DON）的25%[1]。地表水中的主要氨基酸在不同研究中有所不同，其中一些研究报告指出甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸是浓度相对较高的三种主要氨基酸。地表水中的氨基酸组合是游离氨基的4～5倍[2]。然而，肽键中涉及的氮最初不能用于反应，氯和蛋白质之间的反应可以分为两个步骤。首先，发生涉及反应性侧基的快速反应，产生三卤甲烷。其次，包括卤代乙腈在内的其他消毒副产物（DBP）主要是通过多肽主链的缓慢碱催化降解形成的[3]。然而，在典型的饮用水处理条件下，上述组合AAs的反应不太可能发生，所以在地表水中组合AAs浓度较高的情况，FAAs受到了更多的关注。大多数研究都是基于批量实验，其中FAAs的应用浓度可能远高于实际饮用水中的浓度。然而，我国每年要生产大量饮用水，到2020年这一数量将高达200多亿立方米。另外，我国也是一个经常出现饮用水气味问题的国家，而引起气味的化合物目前仍然未知。因此，从饮用水的安全角度看，充分了解饮用水中FAAs的浓度水平是相当重要的，而且相关研究也较少。基于此，本文主要研究通过SPE与UPLC-MS/MS联用测定饮用水源水中15种FAAs的痕量方法，并检测某地区采集的饮用水源水样品中15种FAAs的浓度水平。

1 材料与方法

1.1 化学品和试剂

本试验选择了15种游离氨基酸（FAAs）作为目标化合物，包括丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。每种FAA的纯度至少为99%。L-苏氨酸-2、3-d2和亮氨酸-d3作为内标，购自上海。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）为HPLC级，购自Fisher Scientific（USA）。氢氧化铵（NH3·H2O，14 mol/L）、甲酸（纯度99%）和浓盐酸（32%，HCl）从Sigma-Aldrich（美国）获得。超纯水用于制备试剂级的化学品溶液。使用0.1 mol/L盐酸溶液分别制备15种FAA的单一标准储备溶液（1 mM）和L-苏氨酸-2、3-d2和亮氨酸-d3的标准储备溶液。

1.2 样品采集和制备

水样品采集于四川省8个不同地区的饮用水源水样本。各水样的基本水质参数见表1。所有水样都经过pH调节至 2～3，用50%盐酸稀释，用纯水（v/v）稀释，并用0.45 µm玻璃纤维过滤器在真空下过滤每个水样。所有水样均储存在 温度为30 ℃的环境中。

表1 水质参数

本试验选择强阳离子交换（SCX）固相萃取柱和反相固定相柱。在pH值分别为2.8、4.5和6.5的条件下进行了两种不同类型固相萃取柱的回收率测试。研究发现，反相药筒中FAAs的回收率非常低。另一方面，强阳离子交换柱明显获得了更好的回收率，尤其是在pH值为2.8时。所以将每个水样的pH值调节至2.8，然后在真空下以2 mL/min的流速通过固相萃取柱滤筒，用9 mL乙酸溶液（pH=2.8）、4.5 mL甲醇和9 mL纯水，流速为2 mL/min，装水后，用含有4.5%的甲醇（pH=2.8），将固相萃取柱在真空下干燥30 min，再用8 mL含有5%氢氧化铵的MeOH溶液以2 mL/min的流速进行洗脱。在40 ℃的温和氮气流下蒸发提取物，并用1 mL超纯水重新配制。最后，将提取的样品转移到1.5 mL琥珀色小瓶中，准备进行UPLC-MS/MS分析。

1.3 固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）

利用UPLC-MS/MS进行分析时，使用LC-20ADXR液相色谱仪与配备ESI源的AB Sciex API 4000三重四级质谱仪。流动相A是含有0.2%甲酸的水，而流动相B是含有0.2%乙酸的MeOH/ACN（2：8；v/v）的混合溶液。梯度程序从5%B开始，在2.5 min内线性升至40%B，然后在3分钟内线性增至70%B，最后在0.5 min内升至90%B，同时平衡2 min。在梯度程序的最后阶段，流动相B在0.5 min内向初始条件的5%返回，并保持2 m i n。整个分离过程约为10.5 min。流动相流速设定为0.3 mL/min。柱温保持在35 ℃，进样体积为5.0 µL。

串联质谱（MS/MS）在ESI阳性模式下使用定时多反应监测器（MRM）进行。通过注入单一标准溶液和所有目标化合物的混合物来获得最佳的MS/MS条件。离子源温度为150.0 ℃，离子喷射电压为2 500 V，入口电势为10 V。氮气用作碰撞和去溶剂气体。碰撞压力、离子源1和离子源2气体的压力分别为6 psi、50 psi和50 psi。

1.4 研究方法

本研究对所提出方法的日间和日内精密度、稳定性、回收率进行评价。基于中等浓度的纯标准溶液，在连续三天的三个时间点评估日间和日内精度。通过制备的样品浓度变化来测量各种FAA的稳定性。分别在0、6、12和24 h测试在室温下放置的相同浓度为100 nmol/L的五个水样。每种分析物的稳定性计算为不同时间点测得的浓度与0 h初始浓度的比值。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱条件的优化

首先，本试验研究了用两种不同类型的柱分离浓度为1 µmol/L的纯标准品（图1），即ACQUITY UPLC BEH HILIC柱和ACQUITY UPLC BEH C18柱。结果表明，前一列出现峰值模式干扰，各FAA的响应值受到抑制。15个FAA的峰分离效果较差。相反，后一个柱在短时间内显示出相邻峰之间更好的分离，并且峰模式是平滑的，每个FAA的响应值更好，所以选择ACQUITY UPLC BEH C18柱作为分离柱。与阴性模式相比，阳性模式下的多重反应监测可以获得更高的灵敏度和更好的再现性。目标扫描时间设置为1 s。表2中总结了通过将标准纯溶液直接注入质谱仪获得的优化去簇电位、碰撞能量和碰撞退出电位，其中还包括15种FAA的前体和子离子[4]。

表2 UPLC-MS/MS条件和等电点

2.2 精度和稳定性

本研究总结了天然水样中15种FAA的日内和日间精度以及制备后的稳定性，详见表3，日内和日间精密度分别为3.52 %～ 6.71%和3.34%～ 7.23%。15种FAAs在饮用水源水中的稳定性在92 %～ 110%范围内，表明本研究所建立的方法在室温下可以稳定6、12和24 h，而且具有良好的灵敏度和重复性。

表3 精度和稳定性

本研究表明，当水样pH 值低于3 时只能使痕量污染物在水样中稳定48 h，所以所开发的方法显示出良好的线性（R2＞0.991），而且检测限低（LODs，0.01～0.27 nmol/L）。

2.3 样品提取的优化

水样的pH值是影响固相萃取效果的一个重要因素，所以本实验研究了水样pH值分别为2.8、4.5和6.5时对回收性能的影响。如表4所示，当水样的pH值较低时，15种FAAs在超纯水中的回收率可以显著提高，而降低水样的pH值可以在不离解羧酸基团的情况下使氨基质子化，从而产生FAA的正电荷，进一步促进带负电荷的交换树脂和带正电荷的FAAs之间发生相互作用，可以进一步提高FAAs的回收率。

表4 水样回收率试验的准确性）

尽管降低水样的pH值可以显著提高FAAs的回收率，但当水样的pH值进一步降低到2.8时，水中的一些基质也会被共吸附在SPE柱上，然后从柱上共洗脱，从而导致回收率降低。同时，当水样的pH值增加到中性时，许多FAA的损失可能达到80%。因此，提取前水样的最佳pH值应为2.8。

本研究结果表明，优化的洗脱液是含有4.5%甲醇的4.5 mL的乙酸溶液，其pH值为2.8，在饮用水源水中的回收率为69.8%～117.9%。

3 结论

本研究建立了SPE结合UPLC-MS/MS测定15种FAA的痕量分析方法，并对其进行了优化和验证，结果表明：SPE不仅可以富集FAA，还可以消除基质干扰。该方法具有较好的效果，在RSDs低的饮用水中获得了69.8%～117.9%的良好回收效率。