miR-29a调控细胞凋亡因子影响糖尿病心肌病大鼠心功能的机制

王晓燕 孟建辉

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病患者在没有冠心病、高血压和心脏瓣膜病等情况下,存在的心脏结构和功能异常[1-3]。DCM主要以心肌细胞凋亡、心肌间质纤维化、左心室舒张和收缩功能障碍等为特征[4,5]。DCM是糖尿病患者心源性猝死和死亡的主要原因[6]。因此,DCM的预防和治疗是亟待解决的难题。目前DCM的发病机制仍不清楚,心肌细胞凋亡是促进DCM进展的主要危险因素[7],抑制心肌细胞凋亡有可能成为改善心功能的有效治疗方法。MicroRNAs (miRNAs)是长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA,通过抑制翻译或裂解靶RNA来调节转录后的基因表达。以往的研究表明miRNAs参与了多种生物学过程,包括细胞增殖、分化、转移、凋亡、糖代谢和脂肪代谢等。近期有研究表明miRNAs在DCM中的表达水平发生改变[8],并形成复杂的网络[9,10],miRNAs通过参与转录和转录后调节影响DCM的心脏功能和重构。目前miR-29家族在糖尿病、心血管疾病中的研究日益增多,这些研究主要集中在糖尿病胰岛素抵抗、糖代谢异常、脂代谢异常和全身炎性反应等方面。笔者发现miR-29a是否通过心肌细胞凋亡途径参与了糖尿病心肌病的发病机制,尚不清楚。研究起始时间为2020年10月,本研究采用高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲霉素(streptozotocin, STZ)的方法,成功建立DCM大鼠模型,探讨miR-29a在DCM大鼠心肌细胞凋亡中的作用及其对心功能的影响,从而为DCM的诊治提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 miR-29引物、ReverAid First Strand cDNA Synthesis由广州锐博公司合成。Rrizol Reagent 购于美国Invitrogen公司。RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、蛋白分子量标准购于TaKaRa公司。RIPA蛋白抽提试剂盒购于碧云天生物研究所。磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物购于凯基生物公司。FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I购于美国BD公司。羊抗鼠IgG-HRP购于北京中杉金桥生物公司。GAPDH抗体购于北京赛诺博生物技术中心。Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3和Bak1 抗体均购于Cell signaling Technology Inc。

1.2 实验动物 雄性、10周龄、Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重200±15 g),由河北医科大学实验动物中心提供。常规喂大鼠饲料和饮用水,室温保持在(24±1.0)℃,湿度50%～60%。所有动物使用符合河北医科大学动物管理委员会的要求。

1.3 实验一

1.3.1 动物分组及DCM模型的成功建立:20只SD大鼠随机分为对照组(n=10)和DCM组(n=10)。参考DCM大鼠造模方法[11],模型组大鼠给予高糖高脂饲料(20%蔗糖、10%猪油、基础饲料),于第4、5周末,禁食12 h,2次腹腔注射1%链脲佐菌素(30 mg/kg, STZ),STZ溶液现用现配;对照组大鼠喂正常饲料,于相同时间腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。72 h后采集尾静脉血测定空腹血糖水平(禁食12 h),大鼠连续2次血糖>16.7 mmol/L被纳入DCM组,血糖不达标的被排除。2组大鼠继续喂养10周。

1.3.2 观察指标及方法:观察测定2组大鼠体重、尿量、血压、血糖和HbA1c水平。采用实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法测定2组心肌组织中miR-29a的表达水平。第14周末,采用10%水合氯醛将大鼠麻醉后,开胸取心脏,取心肌组织,每100毫克心肌组织加入1 ml TRIzol试剂,逐步提取总RNAs,Nanodrop 2000鉴定RNAs的浓度和纯度。取原始样品的RNAs合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒检测基因表达水平,在7500定量PCR分析仪上进行qRT-PCR检测,采用相对定量2-△△Ct法分别计算2组心肌组织中miR-29a-3p的表达水平。PCR反应条件:95℃ 预变性10 min,95℃ 变性10 s,60℃ 退火1 min,共40循环。

1.4 实验二

1.4.1 动物分组:将16只SD大鼠随机分为对照组(n=4),DCM组(n=12),DCM大鼠均按实验一方法造模成功(n=12)。将12只DCM大鼠再随机分为:DCM组(n=4),DCM+NC mimics组(n=4)和DCM+miR-29a mimics组(n=4)。分别给予DCM+NC mimics组、DCM+miR-29a mimics组大鼠心肌局部注射携带NC mimics慢病毒(4×107个)和携带miR-29a-3p mimics慢病毒(4×107个),并喂养4组大鼠至满14周。

1.4.2 观察指标:①观察大鼠的心功能:于第14周末大鼠称重后,腹腔注射1%巴比妥钠进行麻醉。大鼠仰卧位固定,剃胸毛。M型超声心动图检测4组大鼠的心功能。②检测指标包括:左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室短轴缩窄率(Left ventricular fractional shortening, LVFS)、舒张早期心室充盈最大速度(E)、舒张晚期心室充盈最大速度(A)、E/A比值、左心室收缩末内径(left ventricular internal dimensions at end systole, LVIDS)、左心室舒张末内径(left ventricular internal dimensions at end diastole, LVIDD)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume, LVESV)和左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)。

1.4.3 观察心肌组织病理学形态及心肌细胞大小:采用HE(hematoxylin and eosin, HE)染色检测并比较心肌细胞大小。 按实验一中的方法给予大鼠麻醉及开胸,取出心肌组织,以多聚甲醛浸泡24 h,石蜡包埋,切片。根据HE染色试剂盒的说明书步骤要求对组织切片进行HE染色。最后在光学显微镜下进行组织病理学检查。

1.4.4 检测心肌细胞凋亡:取心肌组织,经PBS洗涤2次后,大鼠心肌细胞在结合缓冲液中重悬,依据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明步骤,加入荧光探针FITC标记的Annexin V 5 μl和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)10 μl,轻轻混匀,室温避光下孵育10～20 min,进行染色。流式细胞仪检测细胞凋亡。Annexin V-FITC为绿色荧光,PI为红色荧光。

1.4.5 检测心肌细胞凋亡蛋白的表达:采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测凋亡蛋白的表达水平。RIPA细胞裂解液提取大鼠心肌组织细胞总蛋白。取变性的蛋白质样品用SDS/PAGE(12%凝胶),电泳分离蛋白质,转移到PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封存。加入Bcl-2、Mcl-1、Bax、Caspase-3和Bak1一抗(均以1∶1 000稀释)在4℃孵育过夜,然后与羊抗鼠二抗(以1∶10 000稀释)在室温孵育1 h。滴加ECL化学发光液于暗室显影曝光,采用凝胶成像系统扫描和分析条带。蛋白的相对表达量为蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值之比。

2 结果

2.1 实验一结果

2.1.1 DCM大鼠模型的建立及一般资料比较:7只DCM大鼠造模成功,1只死亡,2只血糖未达标被排除实验。10只对照组大鼠均存活。DCM组大鼠的血糖水平、HbAlc水平、收缩压、舒张压和尿量均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组大鼠相比,DCM大鼠早期体重增加明显(P<0.01),而成模时体重下降,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1、2。

表1 2组大鼠一般资料比较

表2 2组大鼠体重情况比较 g,

2.1.2 2组大鼠心肌中miR-29a的表达:qRT-PCR结果所示,与对照组心肌中miR-29a的相对表达量(1.08±0.13)相比,DCM组大鼠心肌细胞中miR-29a的相对表达量显著下调(0.39±0.06),差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 实验二结果

2.2.1 miR-29a对大鼠的心功能的影响:与对照组大鼠相比,DCM大鼠LVEF、LVFS、E/A比值和心率水平降低(P<0.05),LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明显升高(P<0.05);心肌注射miR-29a mimics的DCM大鼠,LVEF和LVFS明显提高(P<0.01),心率水平得到提高(P<0.05),而LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明显降低(均为P<0.01);注射NC mimics的DCM大鼠没有这些改变。见表3。

2.2.2 大鼠心肌组织形态学检测:与对照组心肌细胞(14.09±0.45)μm相比,DCM组和DCM+NC组大鼠出现细胞肥大,分别为(21.81±1.84)μm和(23.26±1.05)μm,差异有统计学意义(P均<0.01),细胞排列混乱,细胞核稀疏,细胞结构破坏等。而DCM+miR-29a mimics组心肌细胞这种病理变化较轻,细胞肥大也减轻(18.33±0.53)μm,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 大鼠横截面心脏组织切片(HE染色×200);A 对照组;B DCM组; C DCM+NC组; D DCM+miR-29amimics组

2.2.3 miR-29a对DCM大鼠心肌细胞凋亡的影响:流式细胞术检测显示,DCM组心肌细胞凋亡率(19.93±2.71)%和DCM+NC组大鼠心肌细胞凋亡率(19.28±1.89)%较对照组心肌细胞凋亡率(2.39±0.34)%比较均明显增加(P<0.01)。与DCM组相比,DCM+miR-29a mimics组大鼠心肌细胞凋亡率(13.02±0.58)%明显降低(P<0.01)。

2.2.4 大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的检测:Western blot检测显示,与对照组相比,DCM组和DCM+NC mimics组大鼠心肌细胞凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Bak1表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1表达水平降低;上调miR-29a抑制了DCM大鼠心肌细胞凋亡蛋白Bax、caspase-3和Bak1的表达水平,提高了Bcl-2和Mcl-1的表达水平。见表4。

表4 大鼠凋亡蛋白的相对表达量比较 n=4,

3 讨论

糖尿病是一种进展性代谢紊乱疾病,其发病率和死亡率每年都在快速增长。DCM是糖尿病患者较严重的心血管并发症,增加了DM患者的死亡率。其原因在于DCM在大多数患者中往往表现出较长的亚临床期,早期不易被发现,很容易进展为心力衰竭,甚至死亡。目前为止,DCM的确切发病机制尚不清楚,进一步明确DCM的发病机制,早期对DCM进行诊断和干预其发病的进程,具有重要的临床意义。

目前临床上很难得到DCM患者的心肌组织和细胞,因此动物模型被广泛应用于DCM机制的研究[12]。本研究采用高糖高脂饮食配合低剂量STZ腹腔注射,来成功建立DCM大鼠模型。与对照组大鼠相比,DCM大鼠逐渐出现萎靡不振、多饮、多食和多尿等糖尿病症状;体重表现为早期增长,实验后期下降的特点;检测血糖水平、HbA1c水平、收缩压和舒张压值均明显升高。这些实验结果与以往研究结果[13]一致。此外,DCM组大鼠的心功能较正常大鼠明显下降。心肌组织HE染色结果也证实了DCM模型大鼠存在严重的DCM相关病理特征。

DCM的发病机制尚不明确,经典的发病机制包括了炎症反应、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、代谢紊乱、线粒体功能异常[14]和氧化应激[15,16]。研究表明心肌细胞凋亡是炎性反应和氧化应激的结果,心肌细胞凋亡所导致的心脏结构和功能异常是DCM发生的重要环节[17]。在细胞凋亡调控基因中,最受关注的是参与线粒体凋亡通路的Bcl-2家族和caspase家族。Bcl-2家族由控制线粒体完整性的抗凋亡因子和促凋亡因子组成,它们在抑制或促进促凋亡蛋白的作用中发挥重要作用。促凋亡蛋白Bax和Bak1通过在线粒体外膜上形成孔介导细胞色素释放,而抗凋亡蛋白Bcl-2主要抑制Bax和Bak1的激活;caspase-3是caspase家族最重要的因子。 本研究中Western blot结果显示,STZ诱导上调了大鼠心肌细胞凋亡蛋白Bax、caspase3和Bak1的表达水平,下调了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表达水平;同时流式细胞术检测显示DCM大鼠的细胞总凋亡率明显增加,说明DCM大鼠确实发生了心肌细胞凋亡,而这种心肌细的损伤是通过上调心肌细胞中Bax、caspase3和Bak1的表达水平及下调Bcl-2和Mcl-1的表达水平来实现的。

研究表明,miRNAs普遍存在于真核生物中,参与多种生物过程,包括细胞增殖、分化、转移、凋亡、葡萄糖代谢、脂肪代谢等[18,19]。miRNAs通过与靶基因的3'-UTR区域结合来调控靶基因的表达,一种miRNA可能调控多个靶基因,同时一种靶基因可能又受多个miRNAs的调控,它们形成了非常复杂而庞大的的网络系统。miR-29家族在血管内皮细胞、主动脉组织、心肌组织和心肌细胞、心脏代谢等多个部位均具有调节作用[20]。MicroRNA-29a在2型糖尿病中与IGF1结合调控心肌微血管内皮细胞增殖和迁移[21];MiR-29在心肌梗死心肌重塑中发挥重要作用[22];Sun等[23]研究表明,miR-29通过外泌体以TRAF-3依赖的方式促进循环单核细胞和巨噬细胞的招募和激活,促进炎症和糖尿病的发生。目前关于疾病针对RNA靶点的干预治疗是新的热点。

为了阐明miR-29a与DCM发病的可能关系,本研究实验一首先分析了miR-29a在大鼠心肌组织中的表达水平的变化情况。实验一结果显示,DCM大鼠心肌组织中miR-29a的表达水平显著下调。那么miR-29a表达下调提示,miR-29a过表达可能成为一种潜在的DCM治疗方法。 因此,本研究实验二探讨了miR-29a模拟剂对DCM大鼠的可能治疗作用。实验结果提示miR-29a对大鼠心肌的保护作用可能是通过影响心肌细胞凋亡相关因子来实现的。DCM大鼠心肌组织注射携带miR-29a mimics慢病毒后,流式细胞术结果显示大鼠的心肌细胞凋亡得到了缓解。进一步Western blot结果表明,miR-29a的上调明显抑制了凋亡相关蛋白Bax、caspase3和Bakl表达水平的增加,并上调了抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表达水平。miR-29a可能通过影响多个细胞凋亡相关因子参与了DCM的发病机制;同时,HE染色表明,miR-29a模拟剂治疗可以减轻DCM大鼠的心肌细胞肥大情况,缓解心肌组织的相关病理特征。心脏超声多普勒成像是检测DCM的有效方法[24],LVEF、LVFS是评价心脏收缩功能的指标,E/A比值用来反映心脏舒张功能。同时本研究结果显示,心肌注射携带miR-29a mimics慢病毒治疗10周后,LVEF和LVFS得到了明显提高,而LVIDS、LVIDD、LVESV和LVEDV明显降低,说明 miR-29a模拟剂治疗可以改善DCM大鼠的心功能,上调心肌细胞miR-29a的水平对DCM大鼠的心肌损伤具有保护作用。过表达miR-29a可以通过降低凋亡蛋白Bax、caspase3和Bakl的表达水平,并升高抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表达水平来缓解DCM大鼠的心肌细胞凋亡,从而改善其心脏功能。

综述所述,DCM大鼠心肌细胞中miR-29a的表达水平降低,上调miR-29a可能通过调控心肌细胞凋亡相关因子减轻DCM大鼠心肌细胞凋亡水平,从而起到改善心功能的作用。本研究可能为DCM的治疗提供新的靶点。